川陳皮素對食管癌KYSE150細胞存活、侵襲和凋亡的影響及機制實驗研究

萬傳科,王曉霞,張彥青,李守霞,閆建軍,王志剛

(1.邯鄲市中心醫院檢驗科,河北 邯鄲 056000;2.邯鄲市中心醫院中醫科,河北 邯鄲 056000)

食管癌在組織病理學上主要分為腺癌和鱗狀細胞癌兩種類型[1-2]。食管腺癌在西方國家迅速增長,但我國大多數患者被診斷為食管鱗狀細胞癌[3-4]。目前的外科手術和藥物治療很少能有效治療晚期食管癌,故患者5年生存率極低[5]。食管癌通常對化學治療藥物不敏感,且不良反應較多。植物來源的天然產物在癌癥治療研究領域發揮著重要作用,如長春新堿、紫杉醇和喜樹堿衍生物等,是目前許多抗癌藥物的來源[6]。作為一種從陳皮中分離出來的多甲氧基黃酮類化合物,川陳皮素可抑制腫瘤細胞增殖,調節癌癥發生和發展[7]。川陳皮素對癌細胞(如結腸癌、胃癌、肝癌等)的增殖均有較好的抑制作用[8],但對食管癌細胞作用的研究較少。研究[9-10]表明,Ras同源基因家族成員A(Ras homologous gene family member A,RhoA)/Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated curly helix protein kinase,ROCK)是與細胞形態維持、平滑肌收縮相關的信號通路。ROCK有ROCK1和ROCK2兩種亞型,均為RhoA下游效應器,在細胞增殖、凋亡和分裂中發揮重要作用[11]。本研究擬基于RhoA/ROCK信號通路探究川陳皮素對食管癌KYSE150細胞存活、凋亡和侵襲的影響,為川陳皮素的應用和食管癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人食管癌KYSE150細胞(批號:KH40219)購自廣東環凱生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 川陳皮素(批號:HA18202,原料藥,純度≥98.5%)、順鉑(批號:HA19245,原料藥,純度≥99.15%)購自杭州華安生物技術公司;胎牛血清、RPMI1640培養基、TRIzol試劑、PCR試劑盒、BCA試劑盒(批號:YM10585、YM25440、YM48450、YM28500、YM21540)購自廣州益滿生物科技公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、結晶紫染液、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、反轉錄試劑盒、蛋白裂解液、ECL試劑(批號:DS34788、DS12628、DS23551、DS33701、DS15210、DS41175)購自廣州東盛生物科技公司;兔源RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批號:AT11589、AT24900、AT25480、AT35819、AT42881)購自深圳安提生物科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養:用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養KYSE150細胞。每24 h更換1次細胞培養液,選擇對數生長期的KYSE150細胞進行實驗。

1.3.2 分組與處理:將KYSE150細胞以5×104個/ml接種于96孔板中(200 μl/孔),分為對照組、順鉑組、川陳皮素低、中、高濃度組。對照組常規培養KYSE150細胞。順鉑組在含KYSE150細胞的培養基中加入0.5 μg/ml順鉑[12]。川陳皮素低、中、高濃度組在含KYSE150細胞的培養基中分別加入10、20、40 μg/ml川陳皮素[13]。上述各組每孔設6個平行樣,繼續培養72 h。

1.3.3 KYSE150細胞存活率檢測:將各組細胞以1×104個/孔接種在96孔板中,培養48 h后加入MTT,37 ℃繼續培養4 h。離心棄上清,加入二甲基亞砜200 μl/孔,振蕩10 min。酶標儀測量490 nm處的吸光度(OD),計算各組KYSE150細胞的存活率。KYSE150細胞存活率(%)=實驗組OD490/對照組OD490×100%。

1.3.4 KYSE150細胞侵襲能力檢測:在Transwell小室的上室中添加基質膠,常溫下固化4 h。在上室中添加1×105個KYSE150細胞,下室中添加RPMI1640培養基。孵育48 h后,4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色,顯微鏡觀察并拍照(隨機選6個視野),計算KYSE150細胞侵襲數目。

1.3.5 KYSE150細胞凋亡率檢測:將各組KYSE150細胞重懸為1×104個/ml,加入Annexin V-FITC和PI,避光孵育25 min。采用流式細胞儀檢測KYSE150細胞凋亡率。

1.3.6 KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達檢測:使用TRIzol試劑提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參,引物由江西瑞威爾生物科技有限公司設計合成,序列見表1。熒光定量PCR反應條件:96 ℃預變性4 min;96 ℃變性16 s,68 ℃退火19 s,73 ℃延伸27 s,共33個循環。以2-ΔΔCt法分析RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.3.7 KYSE150細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達檢測:將各組細胞用蛋白裂解液裂解,BCA試劑盒定量總蛋白。電泳分離各組中等量蛋白質后轉膜,5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,加入兔源RhoA(1∶570稀釋)、ROCK1(1∶660稀釋)、ROCK2(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶1250稀釋)一抗,4 ℃下孵育過夜。加入羊抗兔二抗(1∶2450稀釋),室溫下孵育1 h,加入ECL試劑顯色。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件分析,然后計算RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白相對表達量(以GAPDH為內參)。

2 結 果

2.1 川陳皮素對KYSE150細胞存活率及侵襲能力的影響 見表2(圖1)。與對照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞存活率和侵襲數目降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細胞存活率和侵襲數目升高(均P<0.05)。而川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細胞存活率和侵襲數目比較差異無統計學意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞存活率和侵襲數目依次降低(均P<0.05)。

圖1 各組KYSE150細胞結晶紫染色結果(×200)

表2 川陳皮素對KYSE150細胞存活率及侵襲能力的影響

2.2 川陳皮素對KYSE150細胞凋亡率的影響 見圖2。對照組、順鉑組以及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞凋亡率分別為(6.48±1.16)%、(27.69±5.05)%、(12.65±2.61)%、(18.16±2.75)%、(27.35±4.54)%。與對照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞凋亡率升高(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細胞凋亡率降低(均P<0.05)。而川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。

圖2 各組KYSE150細胞凋亡流式細胞儀檢測結果

2.3 川陳皮素對KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達的影響 見表3。與對照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平升高(均P<0.05)。川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平依次降低(均P<0.05)。

表3 川陳皮素對KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達的影響

2.4 川陳皮素對KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響 見表4。與對照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平升高(均P<0.05)。川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。

表4 川陳皮素對KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響

3 討 論

食管癌是食管上皮細胞的惡性腫瘤,受遺傳、吸煙及不良飲食習慣等因素影響。食管癌可能導致患者出現飲食吞咽困難,引發一系列并發癥,甚至死亡[14]。食管癌病死率較高,發病隱匿,許多患者發現時已處于疾病晚期,化療常常成為主要治療措施[15]。同時,由于合成的抗腫瘤藥物對本病的治療效果較差,許多食管癌患者會出現腫瘤耐藥以及腫瘤復發,因此越來越多學者轉向天然抗癌活性藥物的研究[16-17]。

川陳皮素具有抗癌、抗血栓、抗炎等方面的作用,在多種腫瘤的治療中具有重要的輔助作用。YOU等[18]報道,川陳皮素能夠通過抑制糖原合成酶激酶-3β來抑制膽管癌的增殖和集落形成。ZHANG等[19]研究表明,川陳皮素能夠降低線粒體膜電位,顯著減弱卵巢癌細胞增殖活性,促進凋亡。SOUSA等[20]發現,川陳皮素能夠單獨或和順鉑聯合使用降低間變性甲狀腺癌細胞的活力,同時對正常甲狀腺細胞的毒性較小。WANG等[21]研究發現,川陳皮素可促進乳腺癌細胞焦亡,從而抑制乳腺癌腫瘤進展,有望成為治療乳腺癌的新藥物。本研究使用川陳皮素處理食管癌KYSE150細胞,結果發現低、中及高濃度川陳皮素處理后的KYSE150細胞存活率、侵襲數目較對照組顯著降低,凋亡率顯著升高,且呈現劑量依賴性,與上述報道結果一致[18-21]。表明川陳皮素能夠抑制KYSE150細胞的存活和侵襲,促進細胞凋亡,影響KYSE150細胞生物學行為。

作為與腫瘤進展關系密切的通路,RhoA/ROCK可影響癌細胞生物學行為[22-23]。研究[24]發現,實肌球蛋白磷酸酶靶亞基1能夠通過降低RhoA/ROCK信號通路活性,使得結直腸癌細胞的增殖和遷移能力降低。李登輝等[25]研究表明,激活RhoA/ROCK信號通路能夠促進喉癌細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。LI等[26]報道,降低RhoA/ROCK通路活性能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。有研究[27]報道,RhoA/ ROCK信號通路的激活會促進卵巢癌轉移,導致卵巢癌患者不良預后的發生,而沉默RhoA/ ROCK信號通路會減弱卵巢癌細胞活性,阻礙卵巢癌的進展。本研究發現,低、中及高濃度川陳皮素處理后的食管癌KYSE150細胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低,且呈現劑量依賴性。結合唐軍偉等[24]、LI等[26]和WEI等[27]的研究,我們認為川陳皮素抑制KYSE150細胞的存活和侵襲,促進其凋亡的機制可能與抑制RhoA/ROCK信號通路的激活有關。可能原因為川陳皮素干預后導致RhoA/ROCK通路活性降低,進而影響KYSE150細胞生物學行為,抑制其惡性進展。

綜上所述,川陳皮素能抑制KYSE150細胞存活和侵襲,促進凋亡,其機制可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。本研究不足之處,在于僅探究了川陳皮素通過RhoA/ROCK通路對食管癌KYSE150細胞生物學行為的調控作用,川陳皮素能否通過其他信號通路抑制KYSE150細胞的存活和侵襲,促進凋亡,有待進一步研究。