超聲處理對大黃素-酪蛋白復合物結構及理化性質的影響

劉成力，蘇小紅, ，楊 敏，季 偉，魏玉梅

（1.蘭州工業研究院，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州 730070；3.西北民族大學實驗教學部，甘肅蘭州 730000）

大黃素（Emodin，E）是蒽醌類化合物，是廖科植物中的常見成分，也是我國傳統中草藥大黃的主要活性成分[1]。研究表明，大黃素具有抗氧化、抑菌、抗炎的功效[2-5]。但是，大黃素是疏水性物質，水溶性差，生物利用度較低，因而在制藥行業的應用受到限制[6]。近年來，為了改善疏水性活性分子的水溶性和生物利用度，常以大分子為基質，通過非共價作用將活性分子負載，進而制成微膠囊、乳液、凝膠等制劑。其中，微膠囊因制備工藝簡單而備受關注[6]。蛋白質為天然大分子，營養價值高，且可通過非共價作用自發結合活性小分子，是活性分子載體常見基質；其中，乳蛋白因來源廣泛而成為研究熱點。活性小分子與乳蛋白間易于形成非共價作用，如大黃素與β-乳球蛋白之間以靜電作用力自發結合，大黃酸和大黃酚與β-乳球蛋白均以疏水性相互作用自發結合[7]。

酪蛋白膠束（Micellar casein，MC）是牛乳中酪蛋白的天然存在形態，是一種納米級超分子聚集體，其結構獨特，具有疏水內部和親水表面[8]。研究發現，酪蛋白膠束對多種活性分子具有較高的親和力，與黑米花色苷通過范德華力、氫鍵結合，二者結合常數為5.394×104L/mol[9]；與紫薯花色苷通過范德華力、氫鍵相互作用結合，結合常數高達105L/mol[10]。本團隊前期研究發現，酪蛋白膠束與咖啡酸、咖啡酸苯乙酯均可通過疏水相互作用結合，形成的復合物熱穩定性和DPPH 自由基清除活性高于游離活性分子[11]。另外，酪蛋白膠束對大黃素具有較高的親和力，其結合常數高于103L/mol[12]。

為了進一步提高蛋白質與活性分子間的相互作用，常采用超聲波輔助技術；超聲波處理通過空化作用、機械攪拌、微射流等物理作用，不僅可改善蛋白質的結構及性質，而且可促進蛋白質與小分子結合[13-14]。據報道，高強度超聲處理改善了乳清蛋白、酪蛋白的溶解度[15-16]。本團隊前期研究發現，超聲波處理改善了酪蛋白膠束的溶解性和消化性，且改善作用與超聲波處理時間有關[17]。有文獻指出，超聲波預處理改變了大豆分離蛋白的空間結構，增加了其在pH12 下與兒茶素的結合量，且復合物的溶解度、起泡性、泡沫穩定性及抗氧化能力均有所增加[13]。可見，超聲處理對蛋白質與活性分子復合物的性質具有一定的影響。然而，超聲處理對大黃素-酪蛋白復合物的結構及性質的影響研究鮮有報道。

本文以酪蛋白膠束為載體，在超聲波處理下制備大黃素-酪蛋白復合物，分析復合物結構、形貌及熱分解特性，解析超聲波處理對復合物抗氧化性和胃腸模擬消化性的影響規律。以期為超聲波技術在大黃素-酪蛋白復合物制備中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白膠束 實驗室自制，蛋白質含量為82.77%±1.32%（質量分數）；大黃素、胃蛋白酶（1500 U/mg）、胰蛋白酶（＞2500 U/mg）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-1780 雙光束紫外可見分光光度計 島津儀器公司；NAI-GZJ 型實驗室小型噴霧干燥機 上海那艾精密儀器有限公司；RF-5301PC 熒光分光光度計、S-3400N 掃描電子顯微鏡 日本日立儀器有限責任公司；Nicolet iS50 型FTIR 光譜儀 美國賽默飛世爾科學公司；STA 449 F5 型TG-DSC 熱分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；SFX550 超聲處理儀（20 kHz，探頭直徑12.7 mm）美國布蘭森超聲波公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃素-酪蛋白復合物的制備 稱取適量酪蛋白膠束，加入適量pH6.8 濃度為0.05 moL/L 的磷酸鹽緩沖液，在37 ℃恒溫水浴中磁力攪拌，制得終濃度為20 g/L 的酪蛋白膠束溶液，冷藏備用。準確稱取一定質量的大黃素，加入無水乙醇，將溶液在渦旋儀上震蕩5 min，制得終濃度為2 mg/mL 的大黃素溶液，避光保存。

取100 mL 酪蛋白膠束溶液，并按一定比例加入大黃素溶液，制備大黃素與酪蛋白膠束質量比分別為0、4、8、10 μg/mg 的混合液；其中大黃素濃度為0 μg/mg 的樣品為對照組。將混合液渦旋混勻1 min后置于25 ℃水浴中，將超聲波探頭置于樣品中心處，分別超聲處理0、1、2、3、4、5 min，超聲振幅為30%、脈沖開啟時間5 s、關閉時間1 s，即得超聲處理后的大黃素-酪蛋白復合物。

將超聲處理后的復合物樣品進行噴霧干燥，進口溫度為130 ℃，霧化壓力0.1 MPa，固定撞針間隔時間1 s，撞針執行時間1 s，物料流量為200 mL/h，獲得大黃素-酪蛋白復合物微膠囊粉末。

1.2.2 熒光光譜分析 準確稱取適量樣品粉末，溶于去離子水，配成2 mg/mL 的溶液；參考本團隊前期研究方法[11]，采用熒光分光光度計在室溫下測定上述復合物的熒光光譜，激發波長設定為280 nm，發射光譜采集范圍為290～700 nm，激發波長與發射波長狹縫均為5 nm。

1.2.3 FTIR 分析 將復合物粉末置于ATR 元件，通過FTIR 儀測定其紅外光譜，選擇分辨率為4 cm-1，透射模式下掃描500～4000 cm-1之間的紅外光譜。

1.2.4 熱重及差示掃描量熱（TG-DSC）分析 參照Qin 等[11]的方法，準確稱取4～6 mg 樣品，以同規格空坩堝作為參比，測定復合物在25～500 ℃區間內熱穩定性，升溫速率5 ℃/min。

1.2.5 SEM 分析 取適量復合物粉末置于銅臺上的導電膠條表面，小心涂抹使其分散為薄層，噴金后采用掃描電子顯微鏡觀察，電壓12.0 kV，放大倍數為500。

1.2.6 抗氧化性分析

1.2.6.1 DPPH 自由基清除活性 制備濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 儲備液；制備濃度為0.2 mg/mL的復合物樣品水溶液。將2 mL DPPH 儲備液與2 mL 復合物溶液均勻混合，室溫避光靜置20 min，測定混合液在517 nm 處吸光度，記為A1；將2 mL無水乙醇與2 mL 復合物溶液均勻混合，吸光度記為A2；將2 mL DPPH 儲備液與2 mL 磷酸鹽緩沖液均勻混合，吸光度記為A0。DPPH 自由基清除能力計算如下[18]：

1.2.6.2 ABTS+自由基清除活性 制備7.4 mmol/L的ABTS 原液和2.6 mmol/L 的過硫酸鉀原液，將二者混合均勻并避光保存12 h；用pH7.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋至734 nm 處吸光度值為0.70±0.02，獲得ABTS 儲備液。將3 mL ABTS 儲備液與300 μL 濃度為2 mg/mL 的復合物溶液均勻混合后，室溫下于暗室中靜置6 min，測定混合液在734 nm 處吸光度。ABTS+自由基清除能力計算如下：

式中，A0為ABTS 儲備液與磷酸鹽緩沖液混合后的吸光度；As為ABTS 儲備液與復合物溶液混合后的吸光度。

1.2.7 體外模擬胃腸消化性分析 取100 mg 噴干樣品，分散于2.0 mL 模擬胃液（由2 g/L NaCl、7 mL HCl 和3.2 g/L 胃蛋白酶組成，pH 為1.2）中，并裝入透析袋（1000 Da 分子量）中；將透析袋放置在含有75 mL 無酶胃液和75 mL 無水乙醇組成的混合物的燒杯中，用保鮮膜密封；然后在37 ℃、100 r/min 的搖床中孵育2 h。之后將透析袋中溶液pH 調至7.5 后加入4 mL 模擬腸液（由6.8 g/L KH2PO4、10 g/L胰蛋白酶組成，pH 為7.5）。將透析袋放置在含有75 mL無酶腸液和75 mL 無水乙醇組成的混合物的燒杯中，在37 ℃、100 r/min 的搖床中繼續孵育22 h。在每個特定時間點收集3 mL 透析袋外釋放介質，并添加等體積新鮮介質。采用紫外-可見分光光度計在430 nm 處測定透析液的吸光值，用同一釋放介質中繪制的大黃素標準曲線計算大黃素濃度（y=88.18x-0.0089，R2=0.9992），進而采用下式計算釋放率：

式中，m 為消化液中的大黃素含量，mg；m0為100 mg 噴干樣品中大黃素含量，mg。

1.3 數據處理

所有數據至少為3 次試驗結果，數據以均值±標準偏差表示；采用Origin 9.0 軟件作圖；采用SPSS 19.0 進行單因素方差分析，數據間差異顯著分析采用Duncan 法，以P＜0.05 認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大黃素-酪蛋白復合物的熒光光譜分析

大黃素-酪蛋白的熒光光譜見圖1。由圖1 可以看出，未添加大黃素的酪蛋白樣品最大發射波長為336.8 nm；經過不同時間超聲處理后，酪蛋白的最大發射波長沒有發生變化。文獻[19]指出，當蛋白質的最大發射波長在335～350 nm 時，色氨酸處于疏水微環境；最大發射波長在350～353 nm 時，色氨酸暴露于親水性環境中。也就是說，酪蛋白的色氨酸殘基處于疏水環境中，且超聲處理沒有顯著改變色氨酸微環境。但是，隨著超聲處理時間的延長，酪蛋白最大熒光強度先升高再降低，且超聲處理后樣品的熒光強度均高于未處理樣品。這是因為超聲波產生的空化作用破壞了酪蛋白聚集體，使其溶解性增強，因此熒光強度增大[14,20]。就單一酪蛋白而言，3 min 超聲處理的樣品熒光值最大，之后有所降低，這可能是因為長時間超聲處理導致酪蛋白分子之間、殘留的乳清蛋白及其他物質與酪蛋白之間發生結合所致[21]。

圖1 大黃素-酪蛋白復合物熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of emodin-casein complexes

加入大黃素后，同一超聲處理時間下，大黃素添加量越多，復合物最大熒光強度越低，說明大黃素對酪蛋白熒光產生了猝滅作用，與本團隊前期研究結果一致[12]，但其最大發射波長未發生明顯變化。當大黃素添加量為4 μg/mg（酪蛋白）時，超聲處理對樣品最大熒光值的影響規律與游離酪蛋白基本一致，表現為3 min 處理后復合物熒光值最大，5 min 處理后的復合物熒光值次之。然而，當大黃素添加量進一步增加時，5 min 超聲處理后復合物的熒光值最小，1～3 min 超聲處理對復合物熒光值影響不大。由此可見，大黃素的添加改變了超聲波對酪蛋白的作用。當大黃素添加量較少時，其與酪蛋白結合后對酪蛋白結構影響很小，因此超聲處理對酪蛋白熒光值的影響規律與單一酪蛋白基本一致。當大黃素添加量為8～10 μg/mg 時，其結合于酪蛋白分子上，改變了酪蛋白分子鏈組成和分子間相互作用。此外，短時間超聲處理增強了大黃素與酪蛋白的結合作用。綜上所述，1～3 min 超聲處理對大黃素-酪蛋白復合物熒光值影響不大。

2.2 大黃素-酪蛋白復合物的FTIR 分析

大黃素-酪蛋白的紅外光譜見圖2，其中2 min和4 min 超聲處理樣品紅外譜圖與其他樣品無明顯差異，因此以下在討論中省略。其中，MC 的特征吸收峰出現在1634 和1520 cm-1，分別對應酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶[11]。大黃素紅外譜圖中，3378 cm-1附近為羥基的伸縮振動吸收峰；2977 cm-1為亞甲基的反對稱伸縮振動吸收峰；1618 cm-1為羰基伸縮振動吸收峰；1475 cm-1附近為芳香環骨架伸縮振動、C-H彎曲振動以及C-O 伸縮振動[22]。就單一酪蛋白而言，隨著超聲時間的延長，其紅外譜圖未發生明顯變化，也就是說未產生新的官能團，說明超聲處理未引起酪蛋白基團間的化學反應。另外，酪蛋白的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶位置未發生明顯變化，說明超聲處理未顯著改變酪蛋白的空間結構，與熒光光譜分析結果一致。

圖2 大黃素-酪蛋白復合物的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of emodin-casein complexes

添加大黃素后，復合物的紅外譜圖與酪蛋白紅外譜圖一致，證實了大黃素被包埋在酪蛋白微膠囊內部。本團隊前期研究表明，酪蛋白膠束具有較高的結構穩定性，低濃度的葛根素、黃豆苷元等分子結合不會顯著改變其結構，且可被包埋于微膠囊內部[23]；本文研究結果與該研究結論一致。另外，隨著超聲時間的延長，大黃素-酪蛋白復合物的紅外譜圖未發生明顯變化，且其酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶出峰位置未明顯改變。也就是說，超聲處理不明顯改變大黃素-酪蛋白復合物結構。

2.3 大黃素-酪蛋白復合物的DSC-TG 分析

大黃素-酪蛋白復合物的DSC 曲線如圖3A 所示。由圖3A 可以看出，游離大黃素在260 ℃出現一個尖銳的吸熱峰，為其分解所致。與酪蛋白形成復合物后，大黃素的特征吸熱峰消失，復合物表現出與游離酪蛋白相似的DSC 特征曲線；其中，在50～100 ℃之間均存在一個明顯的吸熱峰，這是由于少量水分蒸發所致；在305 ℃附近，復合物出現較小的吸熱峰，為蛋白質的熱分解峰。就單一酪蛋白而言，超聲處理對其DSC 曲線改變較為明顯。然而，當大黃素添加量達到10 μg/mg 時，不同時間超聲處理后復合物的DSC 曲線較為接近。可見，大黃素的結合削弱了超聲波對酪蛋白的作用，這與熒光分析結果一致。

圖3 大黃素-酪蛋白復合物的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of emodin-casein complexes

圖3B 為大黃素-酪蛋白復合物的TG 曲線。由圖3B 可知，大黃素的失重主要出現在240～320 ℃之間，為其熱分解所致。酪蛋白表現為持續失重，其最大失重出現在240～320 ℃之間，為其熱分解所致，與DSC 曲線變化趨勢一致。大黃素-酪蛋白復合物的失重曲線與游離酪蛋白一致，說明大黃素的添加不改變酪蛋白的熱分解特性，可能是因為其添加量較少。另外，超聲處理后各復合物的TG 曲線與未處理組基本一致，說明超聲處理不改變酪蛋白的失重特性。本團隊前期研究發現，超聲處理提高了酪蛋白膠束的熱變性溫度，但不影響其失重曲線，本研究結果與前期研究結果一致[17]。

2.4 大黃素-酪蛋白復合物的形貌分析

采用掃描電鏡觀察大黃素-酪蛋白復合物的形貌，如圖4 所示。由圖4 可以看出，大黃素-酪蛋白復合物與酪蛋白形貌一致，為褶皺葡萄干狀，與文獻[24]報道一致。就單一酪蛋白而言，3 min 超聲處理使其粒徑趨于均勻，也就說是，3 min 超聲處理削弱了酪蛋白的聚集；5 min 超聲樣品呈現粒度增大趨勢。這與熒光分析結果一致。

圖4 大黃素-酪蛋白復合物的掃描電鏡圖（500×）Fig.4 SEM images of emodin-casein complexes (500×)

與大黃素結合后，復合物粒徑較單一酪蛋白粒徑小，且粒度更為均勻，可能是因為大黃素與酪蛋白結合后，削弱了溶液中酪蛋白膠束間的聚集作用，從而使其噴干物粒徑減小且更加均勻。5 min 超聲后，大黃素-酪蛋白復合物粒徑變得十分均勻。由此可見，超聲處理有利于促進大黃素-酪蛋白復合物粒徑趨于均勻。文獻報道，短時間超聲處理降低了酪蛋白粒徑，本文與其研究結果一致[16,25]。

2.5 大黃素-酪蛋白復合物的抗氧化性分析

游離大黃素及其與酪蛋白形成的復合物的DPPH、ABTS+自由基清除能力如圖5 所示。

圖5 大黃素-酪蛋白復合物的抗氧化特性Fig.5 Antioxidant properties of emodin-casein complexes

由圖5 可以看出，游離大黃素和酪蛋白均具有一定的DPPH 自由基清除力。不同時間超聲處理對酪蛋白的DPPH 自由基清除力影響不顯著（P＞0.05）。結合大黃素后，復合物的DPPH 自由基清除活性與超聲時間有關。三種大黃素添加量下，超聲1 min后，復合物的DPPH 自由基清除活性最低，這可能是因為超聲1 min 促進了大黃素與酪蛋白的結合，掩蔽了大黃素和酪蛋白的活性基團，從而降低了其自由基清除活性。

當超聲時間進一步延長時，復合物的DPPH 自由基清除活性有所升高；其中，大黃素添加量為10 μg/mg 時，復合物的DPPH 自由基清除活性顯著升高（P＜0.05），這可能是因為長時間超聲導致大黃素與酪蛋白結合程度降低，而游離大黃素具有一定的抗氧化性，因此復合體系的抗氧化性升高。

游離大黃素及其與酪蛋白的復合物對ABTS+自由基的清除能力如圖5 所示。由圖可以看出，游離大黃素和酪蛋白均具有一定的ABTS+自由基清除活性，但二者形成的復合物的ABTS+自由基清除活性與單一酪蛋白相當。就單一酪蛋白而言，超聲1 min后，其ABTS+自由基清除活性升高，這是因為超聲空化作用削弱了酪蛋白的聚集，增加了其溶解性[26]。當超聲時間繼續延長時，復合物的ABTS+自由基清除活性降低，這可能是超聲處理改變了活性基團的微環境，從而使其難以發揮ABTS+自由基清除活性。

綜上所述，超聲時間對大黃素-酪蛋白復合物的DPPH、ABTS+自由基清除活性具有顯著影響。

2.6 大黃素-酪蛋白復合物的體外模擬消化分析

體外模擬消化過程中，游離大黃素的釋放曲線如圖6 所示。由圖可以看出，在模擬胃液中，游離大黃素與復合物中的大黃素釋放率均較低，2 h 累積釋放率在10%左右，這是因為復合物在胃液酸性條件下形成沉淀，溶解較慢所致。模擬腸液消化過程中，大黃素添加量為4 μg/mg 的復合物超聲1 min 后，大黃素的4 h 累積釋放率高于其他樣品，這可能是因為短時間超聲促進了大黃素與酪蛋白的結合，使大黃素分散性及溶解性變好，且大黃素結合于酪蛋白表面，更易于擴散至透析液中。消化4 h 后，游離大黃素的累積釋放率高于其他樣品，其12 h 累積釋放率為93.64%±2.68%。

圖6 大黃素-酪蛋白復合物中大黃素的體外模擬釋放曲線Fig.6 Release profiles of emodin from emodin-casein complexes during simulated digestion

總體而言，腸液消化過程中，大黃素累積釋放率與超聲時間有關。消化10 h 后，超聲1 min 樣品中大黃素的累積釋放率最高，其次為未超聲樣品；而超聲5 min 樣品中大黃素的累積釋放率最低。這可能是由于1 min 超聲削弱了酪蛋白的聚集，增加了大黃素與酪蛋白的結合作用，使得大黃素的分散性和溶解性改善，從而使其釋放率增加[26]。超聲5 min 后，部分大黃素可能進入酪蛋白膠束內部，結合的更為緊密，難以釋放；此外，長時間超聲可能削弱大黃素與酪蛋白的結合，降低了大黃素的溶解性，使其難以擴散至透析液，具體機理有待進一步深入研究。本團隊前期研究發現，酪蛋白結合降低了葛根素和黃豆苷元的模擬消化釋放率，本文研究結果與其一致[23]。

3 結論

以酪蛋白膠束為載體，通過超聲處理制備了不同負載量大黃素-酪蛋白復合物微膠囊，系統研究了超聲處理時間對復合物結構及性質的影響。熒光分析結果表明，超聲處理時間對大黃素-酪蛋白復合物熒光的影響規律與大黃素結合量有關，但其對復合物紅外光譜影響不大，且不顯著改變復合物的失重特性。1 min 超聲處理改善了大黃素-酪蛋白復合物的ABTS+自由基清除活性，但削弱了其DPPH 自由基清除能力。另外，超聲處理時間對大黃素的模擬消化釋放率具有影響，其中1 min 超聲處理改善了復合物中大黃素的釋放速率，5 min 超聲處理后復合物中大黃素的釋放率降低。綜上所述，適度超聲處理不改變大黃素-酪蛋白復合物結構，但有助于改善其抗氧化性，并可實現大黃素-酪蛋白復合物中大黃素的模擬消化釋放速率的有效調控。經酪蛋白負載后，大黃素在體內的代謝途徑及生物活性仍有待深入研究，以期更好地支撐酪蛋白作為活性分子負載基質的應用價值。