羊肚菌硒化多糖結構表征及抗運動疲勞作用

趙偉科，楊逍然，王美華

（1.中國礦業大學（北京）體育教研部，北京 100083；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029）

運動性疲勞是機體在長時間或高強度運動后會出現的一種乏力狀態，屬于正常的生理現象，輕微的運動性疲勞會使機體出現動作不協調、肌肉僵硬、酸痛等癥狀，經適當休息后可逐漸得到恢復。然而經常處于運動性疲勞狀態下，會導致身體出現亞健康，進一步引發機體身心疲勞，甚至對臟器造成一定損傷[1-2]。研究表明，糖原消耗、乳酸和尿素氮堆積、氧化應激水平升高、內環境紊亂等均易導致機體疲勞[3-4]。目前，大量研究顯示通過補充外源營養劑可以有效緩解運動疲勞，例如LIU 等[5]研究表明，補充黑豆皮多糖不僅提高小鼠糖原儲備，還提高了抗氧化酶活性，同時降低了乳酸等代謝產物的堆積，從而發揮了較好的抗疲勞作用；張銳等[6]研究表明，補充松杉靈芝多糖后小鼠體內糖原含量和血清抗氧化水平均得到了顯著提高，小鼠的運動耐力顯著高于空白對照組；李英基等[7]研究表明，補充川赤芝多糖后明顯提高了小鼠心肌組織的抗氧化能力，改善了運動疲勞誘導的心肌損傷。這些研究表明補充外源營養物可有效緩解機體的運動疲勞。

羊肚菌（Morchella esculenta）是近幾年研究較多的一種珍稀食藥用真菌，多糖是羊肚菌子實體中最重要的活性物質之一[8]。大量藥理研究表明，羊肚菌多糖（Morchellaspp polysaccharides，Msp）具有免疫調節[9]、保肝護肝[10]、預防老年癡呆[11]、抗血栓[12]、降血脂[13]等功效。多糖的諸多藥理活性與其分子結構密不可分，一些研究表明，采取一定手段對多糖分子結構進行修飾可以明顯提高多糖的藥理活性。目前，對多糖的修飾作用有硒酸化、磷酸化、硫酸化、甲基化等[14]，這些修飾作用不僅會改變多糖的空間結構，還會改進多糖的生物學特性，使得修飾后的多糖具有更高的生物活性[15]。近年來，多糖的硒酸化修飾研究相對較多，主要因為硒酸化修飾得到的硒多糖不僅具有多糖的特性還具有硒的生物活性，研究表明硒多糖的抗氧化、抗疲勞、免疫調節等作用比單獨的多糖和硒元素更強[16-17]。可見，通過硒酸化改性是提高多糖生物活性的一種重要結構修飾方法。

目前對羊肚菌多糖的硒酸化修飾研究較少，對修飾后多糖的結構和抗疲勞作用研究還鮮有報道。鑒于此，本研究為改善羊肚菌多糖的生物活性，擬通過硝酸-亞硒酸鈉（HNO3-Na2SeO3）法對羊肚菌多糖進行硒酸化修飾，同時對硒多糖進行結構表征，并建立大鼠運動疲勞模型探討硒多糖的抗疲勞作用。本研究獲得的硒多糖不僅為羊肚菌資源的深入開發提供理論參考，還可作為富硒補充劑和抗疲勞功能食品的潛在來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌子實體（品種：川羊肚菌1 號）來源于四川省食用菌研究所；亞硒酸鈉（Na2SeO3）西隴科學股份有限公司；氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚 分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；鹽酸、硝酸、無水乙醇、無水硫酸鈉、氯化鋇、氫氧化鈉、抗壞血酸、冰乙酸等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸、PMP 衍生劑、甲醇、乙腈 均為色譜級，北京京科瑞達科技有限公司；血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肝糖原（hepatic glycogen，HG）、肌糖原（muscle glycogen，MG）、蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；線粒體分離試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；SPF 級屏障大鼠 雄性大鼠，5 周齡，65 只，質量（120±25）g，大鼠維持飼料，營養成分符合GB 14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養成分》 斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，倫理試驗批準文號：202 204006；DEAE纖維素層析柱 上海聯邁生物工程有限公司；單糖分析標準品、葡聚糖凝膠G-100 上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖分子量標準物質 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

Varioskan LUX 多功能酶標儀、傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；H1850 離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Beta 2-8 LSCplus 真空冷凍干燥機 德國CHRIST 公司；SN-RE-2000B 旋轉蒸發儀 上海尚儀科技有限公司；HH-501 水浴鍋 常州國華電器有限公司；LC-10A 高效液相色譜儀 日本島津公司；FFA2204E 電子分析天平 常州幸運電子設備有限公司；PF4250 分離純化系統 法國Interchim 公司；Zetasizer Nano ZS90 zeta 電位分析儀 英國Malvern 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌多糖提取 將羊肚菌子實體45 ℃烘干至恒重，粉碎至顆粒直徑小于5 mm，稱取1000 g羊肚菌粉末，按照料液比1:30 g/mL，加入30 L 去離子水，在功率200 W 下超聲波處理15 min，然后在90 ℃水浴鍋中浸提2 h，并重復1 次，將全部濾液旋轉蒸發濃縮至約100 mL，向濃縮液中加入Sevag 試劑，漩渦振蕩后靜置10 min，5000 r/min 離心10 min，取上層液體，重復多次至無蛋白產生為止。加入無水乙醇靜置過夜，5000 r/min 離心10 min 收集沉淀，沉淀依次經無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，去離子水溶解沉淀后，7000 Da 濾膜透析24 h，真空冷凍干燥得到羊肚菌粗多糖粉末，備用。

1.2.2 羊肚菌多糖分級純化 稱取粗多糖20 g，配制成100 mg/mL 水溶液，上樣到纖維素層析柱，用去離子水和0.1、0.3、0.5 mol/L 的氯化鈉溶液洗脫，控制流速0.8 mL/min，自動收集洗脫液，各管收集5 mL，采用苯酚-硫酸法在490 nm 處跟蹤檢測各管吸光值[18]，根據吸光值繪制洗脫曲線。選取收集最多的多糖組分，上樣到葡聚糖凝膠G-100 中進一步純化，合并洗脫液后透析并真空冷凍干燥得到純化羊肚菌多糖（Msp-1）。根據下式分別計算粗多糖得率和純化后多糖的純度。

式中，m0為稱取的羊肚菌粉末質量（g）；m1為提取的粗多糖質量（g）；m2為純化后多糖質量（g）。

1.2.3 Msp-1 硒酸化處理 參考劉韞滔等[19]HNO3-Na2SeO3方法，準確稱取5 g Msp-1 粉末置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 硝酸溶液（0.1 mol/L），45 ℃磁力攪拌使其全部溶解，加入2.5 g 亞硒酸鈉，溶解后再加入15 g 氯化鋇，密封70 ℃磁力攪拌10 h，冷卻至室溫，通過碳酸氫鈉溶液調節pH 至6.5～7.5，加入足量硫酸鈉，振蕩使Ba2+全部沉淀，5000 r/min 離心，將上清液置于透析袋中，截留分子量7000 Da，向透析液中加入抗壞血酸至溶液不變色為止。參考1.2.1 方法，加入無水乙醇沉淀，依次經無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，蒸餾水溶解透析，旋轉蒸發濃縮并真空冷凍干燥得到硒酸化羊肚菌多糖（Se-Msp1）。

1.2.4 Msp-1 和Se-Msp1 化學組成分析 樣品中硒含量測定采用GB 5009.93-2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》[20]；多糖含量測定以葡聚糖為標準品建立標準曲線，采用苯酚-硫酸法測定[18]，y=2.4438x+0.0846，R2=0.9985；蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[21]，y=0.0171x+0.0052，R2=0.9991；糖醛酸含量測定采用間羥基聯苯法[22]，y=0.0022x+0.0014，R2=0.9997。

1.2.5 Msp-1 和Se-Msp1 的傅里葉變換紅外光譜測定 分別稱取適量Msp-1 和Se-Msp1 樣品粉末，加入溴化鉀粉末，混合研磨充分，并在油壓機上將混合粉末制成透明薄片，在紅外光譜儀上掃描，掃描波長為4000～500 cm-1，設置分辨率4 cm-1。

1.2.6 Msp-1 和Se-Msp1 分子量測定 分別配制分子量為4.32×103、1.26×104、6.06×104、1.1×105、2.89×105、5.0×105、2.45×106Da 的葡聚糖標準品溶液1 mg/mL，同時配制1 mg/mL 的樣品溶液。參考竇祖滿的[23]方法，采用高效凝膠滲透色譜法測定樣品重均分子量（Mw）和數均分子量（Mn）大小。

1.2.7 Msp-1 和Se-Msp1 的粒徑和電位測定 分別配制濃度為1 mg/mL 的Msp-1 和Se-Msp1 溶液，在室溫條件通過納米粒度電位儀測量樣品的粒徑大小和Zeta 電位。

1.2.8 Msp-1 和Se-Msp1 的電鏡掃描 分別稱取Msp-1 和Se-Msp1 粉末0.5 g，均勻噴灑在導電雙面膠上，真空噴金處理，在掃描電子顯微鏡下2000 倍觀察。

1.2.9 Msp-1 和Se-Msp1 單糖組成測定 分別配制鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖（galactose，Gal）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalUA）、葡萄糖（glucose，Glu）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、甘露糖（mannose，Man）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，Fuc）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）單糖標準品和Msp-1、Se-Msp1 樣品5 mg/mL，參考金鑫等[24]的方法進行PMP 柱前衍生，配制流動相A[0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）]和B（乙腈），所有溶液均經0.45 μm 過濾。流動相設置A:B=83:17，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長250 nm。

1.2.10 大鼠抗疲勞能力測定 大鼠適應性飼養5 d 后，通過游泳訓練剔除游泳不適大鼠，取30 只隨機分成6 組，每組5 只，分別為空白對照組（Con）、陽性對照組（紅景天苷）、普通多糖組（Msp-1）、硒多糖低劑量組（Se-Msp1-L）、硒多糖中劑量組（Se-Msp1-M）、硒多糖高劑量組（Se-Msp1-H）。多糖處理組每天灌胃劑量參考曹亮[25]的方法，紅景天苷和Msp-1劑量均為100 mg/kg，Se-Msp1-L、Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 灌胃劑量分別為50、100 和200 mg/kg，Con組每天灌胃無菌生理鹽水，灌胃體積均為0.1 mL/（10g·bw），連續灌胃5 周，并在每周最后一天灌胃前對大鼠稱重。試驗的最后一次灌胃結束后大鼠休息60 min，在大鼠尾根處系8%體重鉛塊進行力竭游泳運動，水溫（30±2）℃，水深30 cm，當大鼠四肢運動遲緩，頭部沉入水下10 s 未浮起時，游泳結束，記錄大鼠從放入水中到結束游泳的時間。

1.2.11 大鼠運動疲勞模型建立 取30 只大鼠按體重隨機分成6 組，分別為安靜對照組（Q-CG）、運動疲勞對照組（E-CG）、陽性對照（紅景天苷）、普通多糖組（Msp-1）、硒多糖低劑量組（Se-Msp1-L）、硒多糖中劑量組（Se-Msp1-M）、硒多糖高劑量組（Se-Msp1-H），每組5 只。Q-CG 組、E-CG 組每天灌胃無菌生理鹽水，紅景天苷、多糖組灌胃劑量同方法1.2.10，Q-CG 組不運動，E-CG 組、紅景天苷組、Msp-1組、Se-Msp1 組每天均進行游泳運動。灌胃結束后休息1 h，在大鼠尾根處系5%體重鉛塊進行力竭游泳運動，游泳結束后吹干毛發放入鼠籠繼續飼養，周一至周六上午進行游泳運動，周日休息，連續進行5 周，建立大鼠運動疲勞模型。

1.2.12 大鼠體內糖原、血乳酸、血尿素氮含量測定

在運動疲勞模型試驗中，大鼠最后一次力竭運動結束休息1 h 后，通過麻醉處死，迅速使用注射針刺入血管采血，離心后取上清液保存于凍存管中，同時解剖取后肢四頭肌肌肉（骨骼肌）、肝臟，使用4 ℃生理鹽水清洗干凈并用濾紙吸干表面水分后，剪碎保存于凍存管中，液氮預冷30 min，再轉入-80 ℃冰箱保存。通過試劑盒測定血清中BLA、BUN 含量，取肝臟和骨骼肌肌肉組織，研磨并加入試劑盒提取液，離心取上清液，試劑盒測定肝臟中HG 和骨骼肌中MG 含量。

1.2.13 骨骼肌線粒體中MDA 含量和抗氧化酶活性測定 取冰箱保存的骨骼肌肌肉組織，使用線粒體提取試劑盒，按照說明書操作提取獲得骨骼肌線粒體。取線粒體加入裂解液在冰上研磨，離心取上清液待測，按照試劑盒方法分別測定線粒體中MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性。

1.3 數據處理

Excel 2020 對數據進行整理，采用SPSS 22.0 one-way ANOVA 統計分析，數據用±SD 表示，組間數據采用LSD 檢驗顯著性，P＜0.05 表示數據差異顯著，使用Origin 2018 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌多糖分離純化

經計算，羊肚菌多糖得率為7.21%；圖1A 顯示，經過纖維素柱層析共洗脫出3 個峰，分別為Msp-1（8～18 管）、Msp-2（25～35 管）、Msp-3（50～53 管），占比分別為85.25%、9.38%和2.74%；選取最大組分Msp-1 經葡聚糖凝膠柱層析得到單一洗脫曲線，如圖1B 所示，純化后總多糖質量為7.35 g，純化效率為36.75%。研究表明，經去離子水洗脫所得的多糖通常為中性多糖，經NaCl 溶液洗脫所得多糖通常為酸性多糖[26]。羊肚菌多糖分離所得的Msp-1 為去離子水所洗脫，其為中性多糖，Msp-2 和Msp-3 為NaCl 溶液洗脫所得，均為酸性多糖，說明羊肚菌多糖里中性多糖占比最大，同時還含有一定的酸性多糖，這與張景等[27]研究一致。

圖1 羊肚菌多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Morchella esculenta polysaccharides

2.2 多糖的化學組成分析

從表1 可知，純化后的羊肚菌多糖（Msp-1）未檢出硒元素，而Msp-1 通過硒酸化得到的多糖（Se-Msp1）中硒含量達到9.56 mg/g，說明Msp-1 經過硒酸化處理，Se 與多糖成功結合在一起；Msp-1和Se-Msp1 中多糖含量分別為53.67%和54.34%，Se-Msp1中多糖含量略高于Msp-1，但差異不顯著（P＞0.05）。兩種多糖中均檢測出了少量的蛋白質，Msp-1 中蛋白質含量顯著高于Se-Msp1（P＜0.05），這可能是多糖樣品結構中存在少量糖蛋白，使得蛋白質未清除干凈，而多糖經過硒酸化改性后可能引起了糖蛋白的降解或新引入的Se 官能團取代了糖蛋白分子，從而使得硒酸化改性后的Se-Msp1 中蛋白質含量顯著降低（P＜0.05），這與楊燕敏等[28]、童微等[29]研究結果較一致。另外，多糖樣品中均含有糖醛酸，Msp-1 中糖醛酸含量較低，而Se-Msp1 中糖醛酸含量高達36.82%，Msp-1 主要為中性多糖，Se-Msp1 為酸性多糖，說明羊肚菌多糖經硒酸化處理可將中性多糖轉變成酸性多糖，這與柯宏偉等[30]的研究結果一致。

表1 兩種多糖的化學組成Table 1 Chemical composition of two polysaccharides

2.3 多糖的紅外光譜分析

從圖2 可知，Msp-1 和Se-Msp1 兩種多糖在3358、2928、1633、1422、1118、889 cm-1處有相同的特征吸收峰，3358 cm-1處由羥基（O-H）伸縮振動引起，2928 cm-1處由C-H 基團（CH-、CH2-、CH3-）伸縮振動引起，1633 cm-1處可能為C=O 不對稱拉伸振動，亦或為羧基基團中H 的去質子化和酯化，1422 cm-1處為CH-的變形振動引起、1118 cm-1處為C-O-C 的伸縮振動引起，889 cm-1處為吡喃葡萄糖的特征吸收峰。這些特征吸收峰表明Msp-1 和Se-Msp1 為典型的多糖結構，均存在吡喃糖環，其異頭碳為α構型[31-32]。這與TENG 等[10]、LI 等[33]、KUANG 等[34]研究結果一致。同時也說明硒酸化處理得到的Se-Msp1，其紅外光譜圖與Msp-1 變化較小，硒酸化并未對多糖主鏈結構引起較大的改變，Se-Msp1 依舊保留了多糖的原有構型。然而，Se-Msp1的光譜圖中1189、765、604 cm-1處存在特有的吸收峰，研究表明1189 cm-1多由Se=O 伸縮振動引起，765 cm-1多由O-Se-O 伸縮振動引起，604 cm-1多由Se-O-C 伸縮振動引起[35]。上述結果表明，Msp-1 的硒酸化處理較成功，無機硒（Na2SeO3）通過共價鍵與多糖較好的結合在一起。

圖2 Msp-1 和Se-Msp1 紅外光譜分析Fig.2 Infrared spectral analysis of Msp-1 and Se-Msp1

2.4 多糖的分子量、粒徑和電位分析

建立葡聚糖標準曲線為lg Mw=0.025x+0.788；圖3 可知，Msp-1 的出峰時間為21.88 min，Se-Msp1的出峰時間為20.18 min，分別計算得到Msp-1、Se-Msp1 的Mw分別為1.574×106、3.482×105Da，Mn分別為1.337×106、3.397×105Da。表2 可知，Msp-1 分子量、分散系數（PDI）均大于Se-Msp1，Se-Msp1 的PDI 值接近1，說明硒化改性降低了多糖分子量，提高了多糖均一性和穩定性[36]，該結果與柯宏偉等[30]研究結果一致，可能硒化處理破壞了多糖結構，使其分子量變小，更易于與Se 基團結合。研究表明，小分子量多糖在機體內更易被吸收利用，其生物活性往往高于大分子量多糖[37]，據此推測Se-Msp1 的生物活性可能高于Msp-1。

表2 Msp-1 和Se-Msp1 的分子量、粒徑、電位分析Table 2 Molecular weight,particle size,and potential analysis of Msp-1 and Se-Msp1

圖3 Msp-1 和Se-Msp1 分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Msp-1 and Se-Msp1

從表2 可知，Msp-1 的粒徑顯著大于Se-Msp1（P＜0.05），Se-Msp1 的粒徑降低了49.00%，而Se-Msp1 的絕對電位相比Msp-1 提高了191.22%（P＜0.05），可見Se-Msp1 的分散度較高，穩定性好，說明硒酸化修飾使得多糖表面電荷絕對值顯著升高，進一步提高了羊肚菌多糖在溶液體系中的穩定性，本研究結果與古佩嫻等[38]、LIAO 等[39]研究結果一致。

2.5 多糖電鏡觀察

圖4 為Msp-1 和Se-Msp1 在2000 倍下的掃描電鏡圖。圖中顯示，Msp-1 形貌不規則，凹凸不平，緊密連系在一起，粘性較強，在溶液狀態下易凝結，剛性較強；Se-Msp1 表面同樣凹凸不平，但存在大量的溝壑，表面有很多裂紋，在溶液中易分散溶解，不凝結，穩定性強。說明硒酸化改性使得多糖的結構出現了較大的變化，提高了Se-Msp1 的穩定性。劉韞滔等[19]、古佩嫻等[38]分別對牛肝菌和猴頭菇多糖硒化改性處理，均發現硒化改變了多糖的結構，硒多糖的穩定性更好，這與本研究結果較一致。

圖4 Msp-1 和Se-Msp1 的掃描電鏡圖（2000×）Fig.4 Scanning electron microscopy of Msp-1 and Se-Msp1(2000×)

2.6 多糖的單糖組成分析

Msp-1 和Se-Msp1 兩種多糖的單糖組成見圖5。與單糖標準品比對，發現Msp-1 主要由Man、Glc和Gal 組成，根據峰面積歸一法，Man:Glc:Gal=1:5.64:3.28。多糖經硒酸化修飾后，發現Se-Msp1主要由Man、GlcUA、Glc、GalUA、Gal 組成，摩爾比1:0.42:3.57:3.34:1.86。Msp-1 未檢測到糖醛酸，可能由于含量較低未檢測出，說明Msp-1 的主鏈主要為中性多糖，Se-Msp1 中糖醛酸含量占比為36.91%，其主鏈可能為中性多糖側鏈則為酸性多糖。ZHANG 等[40]和LI 等[33]對羊肚菌多糖進行單糖分析，其結果均顯示羊肚菌多糖主要由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和半乳糖（Gal）組成，葡萄糖含量均最高，這與本研究結果一致。楊燕敏等[28]和王麗波等[41]分別對紅棗多糖和蒲公英多糖進行硒化改性，結果表明，硒化多糖會改變單糖的組成及摩爾比，且糖醛酸含量明顯增高，這與本研究結果相似。本研究中羊肚菌多糖硒酸化處理后，單糖組成中增加了葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，使得多糖從中性變成了酸性，出現這一原因可能是多糖在HNO3和Na2SeO3作用下破壞了糖苷鍵，多糖得到了修飾和加工[42]。

圖5 Msp-1 和Se-Msp1 的單糖組成Fig.5 Monosaccharide composition of Msp-1 and Se-Msp1

2.7 Se-Msp1 對大鼠力竭游泳時間的影響

從圖6 可知，在整個試驗周期中，各組大鼠體重均呈現大幅升高，在試驗前和試驗的第1、2、3、4、5 周時，不同處理組間的大鼠體重均不存在顯著差異（P＞0.05），大鼠體重增加是正常的生長發育引起，說明灌胃紅景天苷和Msp-1、Se-Msp1 均對大鼠生長不存在顯著的促進或抑制作用。與Con 相比，紅景天苷和兩種多糖均顯著提高了大鼠力竭游泳時間（P＜0.01）；與紅景天苷相比，Msp-1 和Se-Msp1-L 組大鼠力竭游泳時間顯著降低（P＜0.05），Se-Msp1-M 不存在顯著差異（P＞0.05），而Se-Msp1-H 組力竭游泳時間顯著提高了7.28%，另外，與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組力竭游泳時間分別顯著提高了9.25%（P＜0.05）和20.69%（P＜0.01），與Se-Msp1-M 相比，Se-Msp1-H 組大鼠力竭游泳時間顯著提高了10.47%（P＜0.05）。上述結果表明，Msp-1、Se-Msp1 均具有較好的抗疲勞作用，兩者中Se-Msp1 效果更好。

圖6 Se-Msp1 對大鼠體重和力竭游泳時間的影響Fig.6 Effect of Se-Msp1 on the weight and exhaustive swimming time in rats

2.8 Se-Msp1 對大鼠肝糖原（HG）和肌糖原（MG）含量的影響

HG 和MG 是給機體提供能量的主要糖原形式，糖原儲備與機體的抗疲勞能力呈正相關，糖原儲備越多機體的抗疲勞能力越強[43]。從圖7 可知，與QCG 相比，E-CG、紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 組大鼠體內HG、MG 含量均顯著降低（P＜0.01），說明力竭游泳運動消耗了體內大量的糖原，運動疲勞模型建立較成功；與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1的HG 和MG 含量均顯著提高（P＜0.01），與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組HG 含量分別顯著提高了18.05%（P＜0.05）、30.40%（P＜0.01），MG含量分別顯著提高了22.12%（P＜0.01）、30.91%（P＜0.01），說明紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 均提高了大鼠體內糖原儲備，發揮了較好的抗疲勞作用，且Se-Msp1 的抗疲勞效果與劑量呈依賴關系，這與曹亮[25]的研究結果相一致。另外，在相同劑量下，與Msp-1 相比，Se-Msp1-M 的HG 和MG 含量分別提高了19.04%、8.89%，表明硒酸化得到的酸性多糖Se-Msp1 對提高糖原儲備具有更好的效果。SHAO等[44]、呂亞輝等[16]分別在研究茶葉硒多糖和靈芝硒多糖的抗疲勞作用時，發現這兩種硒多糖均顯著提高了大鼠體內糖原含量，本文研究的羊肚菌硒多糖具有同樣的效果。

圖7 Se-Msp1 對大鼠體內HG、MG 含量的影響Fig.7 Effect of Se-Msp1 on HG and MG contents in rats

2.9 Se-Msp1 對大鼠血清乳酸（BLA）和尿素氮（BUN）含量的影響

機體在運動過程中會產生BLA 和BUN 等代謝產物，降低了機體的運動耐力[6]。從圖8 可知，與QCG 相比，運動疲勞組的E-CG、紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 組大鼠血清內BLA、BUN 含量均顯著升高（P＜0.01），且E-CG 組的增幅最大，說明大鼠在力竭游泳運動過程中體內產生大量的乳酸和尿素氮，堆積的乳酸和尿素氮滲透到了血清中；與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 低、中、高劑量組大鼠血清內BLA 和BUN 含量均呈顯著降低（P＜0.01），在相同劑量下，與Msp-1 相比，Se-Msp1-M 組BLA 和BUN 分別顯著降低了8.83%、21.44%（P＜0.05、P＜0.01）；與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組BLA 含量分別顯著降低了21.45%、28.72%（P＜0.01），BUN 含量分別顯著降低了14.01%、21.56%（P＜0.05、P＜0.01）。上述結果說明，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 均顯著降低了大鼠體內BLA和BUN 含量，具有較好的抗疲勞效果，Se-Msp1 效果優于Msp-1。QIAN 等[9]發現羊肚菌硒多糖對巨噬細胞的吞噬能力和提高機體的免疫力效果優于普通羊肚菌多糖，這一研究結果與本研究結果共同表明硒化的羊肚菌多糖具有更高的生物活性。

圖8 羊肚菌多糖對大鼠血清中BLA 和BUN 含量的影響Fig.8 Effects of Morchella polysaccharide on BLA and BUN in rat serum

2.10 Se-Msp1 對大鼠骨骼肌線粒體內丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的影響

機體的運動主要靠骨骼肌完成，骨骼肌內線粒體中氧化應激水平升高會抑制線粒體的合成，進而影響到ATP 的生成，降低機體的運動耐力[45]。從圖9 可知，與Q-CG 相比，E-CG 組大鼠骨骼肌線粒體內MDA 含量顯著升高（P＜0.01），SOD、CAT 和GSH-Px 活性均顯著降低（P＜0.01），說明大鼠在運動疲勞狀態下，骨骼肌線粒體內積累了大量的MDA，使得抗氧化酶活性降低，細胞的氧化應激水平升高。與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 低、中、高劑量組MDA 含量均顯著降低（P＜0.01），抗氧化酶活性均顯著升高（P＜0.01），與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組MDA 含量分別顯著降低了8.11%、15.02（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px 活性分別顯著升高了24.52%、20.44%、26.45%和38.86%、37.34%、45.06%（P＜0.01）。綜上，Msp-1、Se-Msp1 在大鼠體內均發揮了較好的抗氧化作用，顯著降低了大鼠骨骼肌線粒體的氧化應激水平，從而發揮較好的抗疲勞作用。此外，相同劑量下，Se-Msp1-M 組MDA 含量和抗氧化酶活性均與紅景天苷組不存在顯著差異（P＞0.05），而Se-Msp1-M 組MDA 含量低于Msp-1 組，抗氧化酶活性則均高于Msp-1 組，進一步提示羊肚菌硒化多糖的抗疲勞作用高于普通多糖，呂亞輝等[16]、姚萬玲[46]分別對靈芝多糖和黨參多糖進行硒化修飾，所得到的硒多糖其清除自由基能力和提高抗氧化酶活性的能力均顯著高于普通多糖。

圖9 Se-Msp1 對大鼠骨骼肌MDA 含量和抗氧化酶活性的影響Fig.9 Effects of Se-Msp1 on MDA content and antioxidant enzyme activity in skeletal muscle of rats

3 結論

本研究從羊肚菌子實體中提取得到羊肚菌普通多糖，經纖維素柱層析分離得到一個最大組分Msp1，其占比達到85.25%；將其通過硒酸化處理得到羊肚菌硒多糖（Se-Msp1），化學組分分析發現Se-Msp1 中硒含量達到9.56 mg/g，多糖含量為56.34%，紅外光譜分析表明，其異頭碳為α構型，重均分子量為3.482×105Da。單糖組成分析結果顯示，Se-Msp1 由Man、GlcUA、Glc、GalUA、Gal 等單糖組成，具體的摩爾比為1:0.42:3.57:3.34:1.86，其中糖醛酸占比36.91%，推測Se-Msp1 的主鏈可能為中性多糖側鏈為酸性多糖。在大鼠的抗疲勞能力測定試驗中，發現Msp-1 和Se-Msp1 均極顯著提高了大鼠力竭游泳時間（P＜0.01），表現出較好的抗疲勞效果，在大鼠的運動疲勞模型中，實驗結果顯示，Se-Msp1 不僅極顯著提高了HG、MG含量（P＜0.01），還降低了BLA、BUN 含量（P＜0.01），同時還降低了骨骼肌中線粒體內MDA 含量（P＜0.01），提高了線粒體內抗氧化酶活性（P＜0.01），進而表現出較好的抗疲勞作用。另外，經過硒酸化得到的Se-Msp1 的抗疲勞作用效果顯著高于普通多糖Msp-1。本研究為羊肚菌多糖的深入開發利用提供了新思路，同時也為開發天然有機硒補充劑提供了理論參考，接下來將會繼續研究解析羊肚菌硒多糖結構，并進一步分析硒多糖的抗疲勞作用機制。