富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質提取工藝優化及氨基酸組成分析

高慧娟，陳月娟 ，楊艷輝，黃建花，曹 陽，趙 麗，張 楠，朱子雄，魏生龍

（1.河西學院生命科學與工程學院，甘肅張掖 734000；2.甘肅省應用真菌工程實驗室，甘肅張掖 734000；3.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖 734000；4.臨澤縣怡泉新禾農業科技發展有限公司，甘肅張掖 734200）

硒是生物體必需的微量礦質元素[1]，對人類健康有著極其重要的作用。人體硒的主要來源是通過食物攝入[2]，但是人們很難從本土自然食物中攝入硒以達到補硒的目的。人工外源施硒培養技術可以提高食物中硒的含量。食用菌具有從生長底物中吸收硒的能力，通過菌絲體的代謝，將無機硒轉化為有機硒，有機硒主要以硒蛋白質、硒多糖、硒核酸、含硒多肽、硒黃酮等形式存在，其中又以含硒蛋白為主[3]。食用菌經富硒處理后不僅提升了本身的營養功效，還能更好地被人體吸收[4]，可以用于生產高硒新型食品補充劑[5]。

近年來，隨著人們生活水平提高及對健康的重視，味道鮮美、營養豐富、綠色健康的食用菌及其制品越來越受到消費者的喜愛。荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）被稱作香味松口蘑或美味玉蕈，是離褶傘屬一種市場前景較好的珍稀食用菌[6]，也是一種藥用真菌[7]。蛋白質營養是衡量食物營養的重要組成部分[8]，也是對食用菌營養學評價的一個重要方面，也是氨基酸種類和含量評價的重要指標。研究表明，荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質含量大于20%，蛋白質的均衡性優于子實體，營養價值比子實體更高，極具生產和食用價值[9]。此外，荷葉離褶傘還具有較強的富硒能力[10]，硒在攝入人體后可以增加機體中硒蛋白含量[11]，提升其營養價值。目前國內外有關荷葉離褶傘硒蛋白的報道還很少，有必要對富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質提取工藝進行優化。

因此，本試驗以富硒的荷葉離褶傘菌絲體為原料，采用超聲輔助提取，對蛋白的提取工藝進行優化，并對蛋白質中硒的含量進行測定，以氨基酸分析測定儀檢測荷葉離褶傘菌絲體富硒前后，蛋白質中的氨基酸種類和數量的變化，了解硒對荷葉離褶傘菌絲體中氨基酸的影響，為進一步研發食用菌富硒菌絲蛋白質保健品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

荷葉離褶傘1022 菌株 甘肅省應用真菌工程實驗室提供；標準牛血清蛋白（分析純）、硒粉（化學純CP）、3,3'-二氨基聯苯胺（化學純CAS）國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為分析純；玉米粉、大豆蛋白粉 甘肅張掖新樂超市。

V-1200 型可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；TDL-50 大容量低速離心機金壇市億能實驗儀器場；LGJ-18 真空冷凍干燥機 北京松源華科技發展有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-250B 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；L-8900 氨基酸分析測定儀 日本日立公司；氨基酸柱 安米諾西斯公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體中蛋白質的提取工藝 荷葉離褶傘菌絲體→活化→加硒→搖瓶發酵→加入20 L 發酵罐→發酵→得到富硒菌絲體→干燥→粉碎→加堿液攪拌→超聲輔助提取→離心→上清液→調節pH 直至等電點→離心→回溶→冷凍干燥→蛋白樣品

操作要點：在20 L 生物發酵罐中加入玉米粉和大豆蛋白粉水解液的培養基，滅菌冷卻后接入8.5%種子液（將活化的荷葉離褶傘菌絲體菌塊接入PDA 培養基中，在搖床發酵8 d 的發酵液），發酵至第3 d，在發酵液中加入Na2SeO3溶液，使發酵液中硒含量為4 μg/mL，待發酵至第8 d 時，終止發酵，過濾并清洗菌絲體，放入真空干燥機中干燥，磨粉制成100 目標準粉[12]，稱取0.5 g 該標準粉，加入濃度為0.05 mol/L NaOH 溶液，使用超聲輔助提取后，然后在3000 r/min 轉速下離心15 min，然后調節上清液至等電點，再次離心得蛋白沉淀，最后將蛋白沉淀加入少量蒸餾水調節至pH7.0 回溶。放在真空冷凍干燥機中干燥得蛋白樣品。

1.2.2 蛋白質等電點的測定 按照文獻[13]方法測定蛋白質等電點，略作修改。將富硒荷葉離褶傘菌絲體與0.05 mol/L 的NaOH 溶液以55:1 液料比進行混合，置于磁力攪拌器中53 ℃提取2 h，冷卻至室溫后離心（3000 r/min，15 min）取上清液。分別取30 mL 上清液于8 個50 mL 的燒杯中，分別用1 mol/L 的 HCl 溶液調節pH 為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，室溫下靜置2 h 后離心（8000 r/min，10 min），測定上清液蛋白質含量。

1.2.3 蛋白提取率的測定 按照文獻[14]中雙縮脲法測定蛋白質的提取率。

1.2.3.1 蛋白質標準品溶液 準確稱取1.0 g 牛血清白蛋白，用水配制成含量為10 mg/mL 的標準蛋白溶液，分別取出0、1、2、3、4 和5 mL，轉入6 支比色管，各加入20 mL 雙縮脲試劑，并分別加水補足到25 mL，室溫下反應30 min，以蒸餾水為空白，于550 nm測定吸光度值，然后以蛋白質含量為橫坐標（mg/mL），吸光值為縱坐標，得回歸方程Y=0.1985X+0.0665，決定系數R2=0.9990。

1.2.3.2 樣品中蛋白質提取率的測定 取5 mL 超聲提取后離心的上清液，加入20 mL 雙縮脲試劑，并加水補足到25 mL，充分混勻后，室溫下放置30 min，在550 nm 下測定吸光值。

式中，C：從標準曲線查得樣品的吸光值所對應的蛋白質濃度（mg/mL）；V1：反應體系的總體積（mL）；V2：用于顯色的樣品體積（mL）；V0：樣品稀釋后總體積（mL）；m：樣品中蛋白質（由等電點處沉淀的蛋白質凍干所得）的質量（g）。

1.2.4 富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白提取單因素實驗

1.2.4.1 提取溫度對蛋白提取率的影響 準確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇不同提取溫度（50、60、70 和80 ℃），堿液濃度為0.05 mol/L，液料比為150:1 g/mL，提取時間為20 min，提取1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白質含量，研究提取時間對菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.2 提取時間對蛋白提取率的影響 準確稱取富硒的樣品0.5000 g，在1.2.3.1 最優提取溫度下，選擇不同提取時間（20、40、60、80 和100 min），堿液濃度為0.05 mol/L，液料比為150:1 g/mL，提取時間為60 min，提取次數為1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白提取率，研究提取時間對菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.3 液料比對蛋白提取率的影響 準確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇1.2.3.1 中最優提取時間，在60 ℃水浴中，堿液濃度為0.05 mol/L，選擇不同液料比（150:1、200:1、250:1、300:1 和400:1 g/mL），提取1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白提取率，研究液料比對菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.4 提取次數對蛋白提取率的影響 準確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇最優提取時間、液料比和提取溫度，在不同提取次數（1、2、3 和4 次）下，于0.05 mol/L 堿液中超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min下離心15 min，測定蛋白提取率，研究提取時間對菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.5 富硒菌絲體中蛋白質提取工藝的響應面試驗

根據單因素實驗結果，運用Design-expert 8.0 軟件系統，采用Box-Behnken 響應面設計法[15]，以蛋白提取率為響應值，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）和提取次數（D）四個因素，設計4 因素3 水平試驗，因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 蛋白樣品中硒含量測定 根據文獻[16]方法稍作修改測定蛋白樣品中硒含量。

1.2.6.1 硒標準曲線的繪制 精確稱取0.10 g 硒標準品溶解于2 mL 濃硝酸中，低溫下（65～70 ℃）加熱溶解至蒸干，用體積比為1:1 的濃鹽酸溶解，定容至1 L，使用時用蒸餾水稀釋至1 μg/mL 制得硒標準溶液。準確吸取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 mL 的硒標準溶液（1.0 μg/mL），分別置于125 mL 分液漏斗中，加水定容至25 mL，分別加入5% EDTA-2Na 溶液1 mL，用體積比為1:1 的濃HCl 調節溶液至pH2～3，再加入0.5% 3,3'-二氨基聯苯胺溶液4 mL，搖勻，置暗處20 min 后，用10% NaOH 溶液調節至pH7～7.5，加入10 mL 甲苯振蕩2 min 靜置分層，棄水層，甲苯層用比色皿于420 nm 處測其吸光值。以硒含量（μg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得回歸方程為Y=0.0151X-0.0014，決定系數R2=0.9996。

1.2.6.2 樣品的處理及硒含量測定 準確稱取0.05 g樣品溶于2 mL 濃硝酸，在電熱爐中加熱（控制溫度160～180 ℃）消化，至樣品完全溶解，溶液呈澄清，停止加熱并冷卻至70 ℃，加入體積比為1:1 濃HCl 定容至10 mL，備用。準確移取上述備用溶液0.2 mL，用水定容至25 mL 轉入125 mL 分液漏斗中，此時若有白色沉淀物（可能是硅膠）應用濾紙過濾，分別加入5% EDTA-2Na 溶液1 mL 后步驟同1.2.6.1 中標準曲線的制作方法。根據樣品溶液測得的吸光值，結合硒標準曲線查找、計算相應的硒含量。

式中，C：從標準曲線查得樣品的吸光值所對應的硒濃度（mg/mL）；V1：反應體系的總體積；n：樣品稀釋倍數；m：菌絲體樣品中蛋白質的質量（g）。

1.2.7 富硒菌絲體中蛋白質氨基酸種類和含量測定

1.2.7.1 蛋白樣品的前處理 稱取提取的蛋白質0.1000 g 置于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L 的鹽酸，將封口嚴密的水解管放在（110±1）℃的恒溫干燥箱內水解22 h 后，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉入25 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度，取濾液1 mL 置于25 mL 小燒杯中，在40～50 ℃的真空干燥箱中烘干（如有殘留物，用1～2 mL 去離子水溶解，再干燥），加入5 mL 0.02 mol/L 的鹽酸溶液溶解作為待測液。

1.2.7.2 測定分析條件 氨基酸柱；單樣品分析周期為30 min。分離柱的條件為：洗脫液的流速0.40 mL/min，柱溫70 ℃，柱壓8.627 MPa；反應柱的條件為：茚三酮及茚三酮緩沖液的流速0.35 mL/min，柱溫135 ℃，柱壓0.982 MPa，檢測波長：440 nm/570 nm雙波長同時檢測；反應溫度：135 ℃；分別取標準溶液及試樣20 μL 進樣[17]。

1.2.8 營養價值評價 采用化學評分（chemical score，CS）、氨基酸評分（amino acid score，AAS）對富硒荷葉離褶傘菌絲體進行營養價值評價[18]。

1.3 數據處理

實驗中的每組數據均為3 次重復的平均值，采用Design-Expert 13 軟件進行響應面設計和統計結果分析，采用Origin 2018 進行圖表處理。

2 結果與分析

2.1 蛋白質等電點的確定

如圖1 所示，上清液中蛋白質的含量，隨著pH 增加呈現凹形，pH 從2.5～3.5，隨著pH 增加，上清液中蛋白質含量在急劇降低，從3.5 以后開始又緩慢增加，4.5 以后迅速增加，在5.0 時達到最大值22.5%。說明提取液上清中蛋白質在pH3.5～4.5 的溶解度較低，在此范圍之外，蛋白含量均較大。pH在3.5～4.5 范圍內，上清液中蛋白質殘留濃度較低，而在3.5 處蛋白質所帶電荷為零，溶解度最低，推測富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質的等電點在3.5 左右，這和王梓杭等[18]對香菇中蛋白質的提取工藝中等電點的測定值（3.8）相接近。

圖1 蛋白質等電點的測定Fig.1 Determination of protein isoelectic point

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取溫度對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

如圖2 所示，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率也在增加，提取溫度越高，堿提效果也越好。但提取溫度超過60 ℃以后，蛋白提取率隨提取溫度變化的趨勢減小，并且有文獻[19]報道，蛋白的變性溫度為70～80 ℃，由此確定實際提取溫度為60 ℃。這與田敏爵等[20]對富硒猴頭菌中硒蛋白提取工藝的研究中的結論相似。

圖2 提取溫度對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.2 提取時間對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

如圖3 所示，隨提取時間的增加，蛋白提取率不斷增加，在提取時間為60 min 時，達到最大43.69%。提取時間超過60 min 后，隨著提取時間延長，蛋白提取率呈現緩慢下降趨勢，可能是提取時間增加后，蛋白質溶出量已飽和，因此選擇60 min 為優化試驗條件。

圖3 提取時間對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of reaction time on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.3 液料比對對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

由圖4 可知，隨著液料比的增大，蛋白質提取率也在增加，液料比200:1 mL/g 時達到44.95%，之后隨液料比的增加，蛋白質提取率的提高不明顯。可能是因為隨著溶劑的增加，固液相中的濃度差增大，溶質溶出速度增大[21]，使得蛋白提取率增加。但是液料比過大會給隨后的濃縮步驟造成負擔，考慮工藝過程中溶劑使用量和降低生產成本方面的考慮，確定液料比為200:1 mL/g。

圖4 液料比對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.4 提取次數對對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響 由圖5 可知，隨著提取次數增多，蛋白提取率增加，堿提2 次的蛋白提取率為61.39%，之后隨著提取次數增加，蛋白提取率增加幅度緩慢，說明堿提2 次可以有效地將蛋白充分提出，考慮到提取效率，選擇2 次為最佳提取次數。

圖5 提取次數對富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of reaction times on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.3 響應面試驗結果

根據Box-Behnken 的中心組合設計原理，試驗中對4 因素各取3 水平，設計了29個試驗點的響應面分析試驗，結果見表2。經Design-Expert 統計分析軟件進行多元回歸分析，所得的方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 響應面試驗的方差分析結果Table 3 ANOVA results of factors and model in the response surface experiment

利用軟件Design Expert8.0 對實驗結果進行分析得到多元二次回歸方程：Y1=74.23+7.02A+0.98B+2.48C+12.61D-1.36AB-5.57AC-1.63AD-2.31BC-3.29BD-5.91CD-9.08A2-10.80B2-10.35C2-19.36D2。

由表3 可知，模型項顯著，P＜0.0001，失擬項不顯著，P=0.1439＞0.05，決定系數R2=0.9307，說明模型可用，回歸擬合程度較好。A、D、A2、B2、C2、D2對響應值的影響均達到極顯著水平（P＜0.01），B、C、AB、AC、AD、CD、BD、BC 對響應值的影響均不顯著。由F值可知，影響蛋白提取率主要因素依次為D＞A＞C＞B，即提取次數＞提取溫度＞液料比＞提取時間。利用Design Expert 8.0 軟件可以得兩兩因子交互作用的響應面圖。響應面坡面的陡峭程度及等高線的疏密、形狀可反映出交互作用對響應值影響的強弱，響應面坡度陡峭，等高線密集且趨于橢圓表示兩因素交互作用對響應值的影響顯著，而響應面坡度平緩，等高線稀疏且趨于圓形則與之相反。圖6 反映兩因素交互作用對富硒荷葉離褶傘中蛋白提取率的影響，圖中響應面坡度較平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取時間、提取溫度、提取次數和液料比的兩兩交互作用對蛋白質提取率影響不顯著，這與方差分析結果一致。

圖6 各因素交互作用對富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白提取率的響應面圖Fig.6 Response surface of the interaction of various factors on the protein extraction rate of selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia

2.4 驗證試驗

Design-Expert 8.0 統計分析軟件進行數據分析，得到荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白的最佳提取工藝條件：提取溫度63.81 ℃、提取時間59.80 min、液料比196.36:1 g/mL、提取次數2.32 次，理論上蛋白提取率為77.50%。考慮到實驗的可行性，將最佳條件調整為提取溫度64 ℃、提取時間60 min、液料比200:1 g/mL、提取次數2 次。在此條件下，對荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白進行提取，通過3 次平行試驗，測得蛋白提取率為75.13%，相對誤差為2.36%，證明優化的荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白的最適提取工藝條件可行，這與王蓮芳等[22]研究富硒食用菌中蛋白得率為30.17%的結果不同，在優化條件相同的同等條件下，未富硒菌絲體中蛋白質提取率為52.11%，說明未富硒菌絲體中含有的蛋白含量低，富硒能夠提高菌絲體中的蛋白質含量[23]。

2.5 富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白質中硒含量測定

富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白中硒含量為63.87±4.18 μg/g。推測荷葉離褶傘菌絲體發酵過程中加入無機硒，可以通過生物轉化進入蛋白質中。

2.6 富硒菌荷葉離褶傘菌絲體蛋白質中氨基酸色譜分析

實驗所測得氨基酸混合標準品的色譜圖見圖7，17 種氨基酸在選定的分離條件下，可以達到很好的分離效果。荷葉離褶傘菌絲體富硒前后的蛋白質中均含有14 種氨基酸（色氨酸在水解過程中遭到破壞），Cys 和Lie 兩種氨基酸含量未檢出。富硒后菌絲體蛋白質中的氨基酸，除Pro 外，其他氨基酸含量均比未富硒菌絲體中含量高，其中Ala 和Lys 兩種氨基酸含量較未富硒的菌絲體中含量高出一倍以上（表4）。

圖7 氨基酸標準品色譜圖Fig.7 Chromatogram of amino acid standard

表4 富硒前后荷葉離褶傘菌絲體蛋白質中氨基酸組成及含量Table 4 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment

富硒菌絲體蛋白中總氨基酸含量（TAA）和人體必需氨基酸的含量（EAA）分別為51.18 和17.20 g/100 g，較未富硒中的含量高出20.33%和19.75%，EAA/TAA 的值為33.61，EAA/NEAA 的值為0.51，與FAO/WHO 提出的理想蛋白的標準進行判斷，荷葉離褶傘菌絲體富硒前后蛋白接近該標準，說明荷葉離褶傘菌絲體富硒前后均具有一定的營養價值，且硒能促進荷葉離褶傘菌絲體中大部分氨基酸的合成，這和富硒姬松茸[24]、松杉靈芝[25]菌絲體蛋白質中氨基酸含量變化的研究結果一致。

由表4 可知，富硒荷葉離褶傘菌絲體中必需氨基酸的含量為33.61%，和不富硒的菌絲體中必需氨基酸含量相當。由表5 可知，必需氨基酸Thr、Leu、Phe+Tyr 占總氨基酸的質量分數比FAO/WHO 提出的理想蛋白標準的高，Lys 和Met+Cys 的質量分數比標準低。CS 越接近100 分，表明樣品與雞蛋蛋白越接近；AAS 越接近100 分，表明樣品與WHO/FAO模式蛋白越接近。Lys、Phe+Tyr 和Met+Cys 的CS較低，其他必需氨基酸均在80 分以上，因此荷葉離褶傘菌絲體蛋白的限制性氨基酸為Lys、Phe+Tyr和Met+Cys；Lys 和Met+Cys 的AAS 較低，其他必需氨基酸均超過100，說明菌絲體具有良好的營養價值，且富硒菌絲體的營養價值更高一些。

表5 富硒前后荷葉離褶傘菌絲體蛋白質中必需氨基酸組成評價Table 5 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment

3 結論

該研究采用目前在食用菌蛋白質提取中常采用的超聲輔助堿提取蛋白法，通過單因素實驗和Boxbenhnken 中心組合響應面試驗法，對富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質進行了優化試驗，確定了最佳提取工藝條件：提取時間60 min、提取溫度60 ℃、液料比200:1 g/mL、提取次數為2 次，蛋白提取率為76.90%。并且采用3,3’-二氨基聯苯胺分光光度法測定菌絲體蛋白質中的硒含量為63.87 μg/g，通過添加無機硒進行發酵生產菌絲體，可以使硒進入菌絲體蛋白中。分析發現，富硒菌絲體中有17 種氨基酸，其中必需氨基酸含量占33.61%，和非必需氨基酸的比值為0.5，氨基酸組成較為合理，荷葉離褶傘菌絲體富硒前后均具有很高的營養價值，富硒的營養價值更高，是一種優質的蛋白來源，且其中含有一定量的硒，大大提高菌絲體的營養價值和利用價值，這為富硒荷葉離褶傘菌絲體的進一步開發利用提供了可靠的理論依據，具有廣闊的應用前景。