淀粉-枸杞復合物的制備及其穩定性研究

李淑敏，郭晉彪，于金芝，周雅頻，張 蕾，何希宏，郝利民,，張黎明,

（1.天津科技大學，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.軍事科學院系統工程研究院，北京 100010）

枸杞（Lycium barbarum，LB），作為一種傳統的藥食同源類食品，在我國已有2000 多年的食用歷史[1]。現有的研究表明，枸杞的生物活性物質主要有枸杞色素（Lycium barbarumpigment，LP）、枸杞多糖、氨基酸和微量元素等[2]，在調節機體新陳代謝、保護視覺、血糖調節、免疫調節、抗腫瘤活性和細胞保護等方面有著積極的效果[3]。

LP 是一種由類胡蘿卜素和黃酮組成的活性物質，對枸杞生物活性的發揮起著關鍵作用[4]。然而，相較于枸杞中其它活性成分，LP 存在著穩定性差，不易保藏等問題。氧氣、光照和高溫是主要的誘導因素，容易使其發生褐變，導致其生物活性減弱，從而降低了LP 的生物活性和生物利用度[5]。目前，提高LP 穩定性的研究已逐漸受到關注，張春蘭等[6]制備了LP 微乳液，通過添加抗氧化劑和EDTA-2Na 提高了LP 的穩定性；劉永等[7]通過海藻酸鈉和殼聚糖作為LP 的載體，顯著降低了高溫、光照和氧氣等誘導因素對LP 的破壞，延長其儲藏期。但是這些方法存在著生產成本高、加工流程復雜等問題，因此不適于LP 包含體復合物的實際生產加工。

近年來，通過以淀粉作為載體制備復合物增加客體分子穩定性的研究已較為廣泛。淀粉是一種由直鏈淀粉和支鏈淀粉以特定交錯排列方式形成的晶體顆粒[8]。當存在疏水性客體分子時，直鏈淀粉可自發形成“內部疏水，外部親水”的單螺旋空腔體結構[9]。疏水性客體分子可通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力等非共價作用進入淀粉單螺旋空腔或鑲嵌在兩個螺旋空腔之間，從而形成復合物[10]。ANDREA等[11]制備了高直鏈淀粉-脂肪酸復合物，該復合物可顯著降低氧氣和溫度對脂肪酸的影響，提高了脂肪酸的穩定性。WANG 等[12]所制備的直鏈淀粉-兒茶素復合物和HOYOS 等[13]制備的淀粉-杏仁油復合物也有相似的效果，所裝載的客體分子的穩定性均顯著提升。因此，本研究擬選擇淀粉為載體，以LP 含量為指標，探索一種新型的有效保護枸杞活性物質的CS-LB 制備方法，通過考察其理化性質來揭示該復合物的形成方式，并進一步對該類復合物的穩定性進行考察，為LB 的高效利用提供新的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉（直鏈淀粉含量為27.5%，水分含量為12.7%）天津中英保健食品有限公司；枸杞（水分含量為10.2%）寧夏寧馨兒生物科技有限公司；β-胡蘿卜素標準品（CAS：7235-40-7，HPLC≥98%）北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純。

PB12 Power311 型高速破壁機 廣東美的電器有限公司；Alpha 2-4 LD plus 型真空冷凍干燥機德國奇爾斯特公司；TU-1810PC 型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Philips XL-30 型掃描電子顯微鏡 荷蘭飛利浦公司；Rigaku D/max 2500X 射線衍射儀 日本理學株式會社；Pyris/Diamond 型熱重分析儀 美國Perkin-Elmer公司；Vector-22 型傅里葉紅外光譜儀 德國布魯克儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CS-LB 制備方法 CS-LB 的制備參照張黎明等[14]的方法并稍作修改。將8%的淀粉勻漿于90 ℃加熱處理2 min 使淀粉預糊化，并按照一定質量比加入枸杞進行高速剪切處理，然后對樣品進行真空冷凍干燥、研磨過篩處理。再利用無水乙醇洗滌3 次，于-80 ℃，0.35 atm 的條件下冷凍干燥24 h 并過100 目篩即得CS-LB。然后對其LP 的含量和包埋率進行測定。

1.2.2 制備條件的優化 利用復合物中LP 的含量和包埋率篩選復合物的較佳制備條件。首先在剪切速率8000 r/min、枸杞與淀粉質量比（干重）為3:1的條件下，將混合勻漿分別剪切不同時間（0.5～3 h，以30 min 為間隔）以確定制備復合物的較優剪切時間。在確定較優剪切時間后，固定枸杞與淀粉質量比（干重）為3:1，設置破壁機不同剪切速率（8000～28000 r/min，以4000 r/min 為間隔）高速剪切1.5 h以確定制備復合物的較優剪切速率。確定較優剪切速率和剪切時間后，在預糊化淀粉冷卻過程中加入不同質量的枸杞，使枸杞:淀粉的質量比（干重）分別為1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，對枸杞與淀粉的質量比（干重）進行優化，以確定制備復合物的較優質量比。

1.2.3 對照樣品的制備 枸杞粉的制備：稱取一定質量的枸杞置于90 ℃的熱水中加熱處理2 min，然后在冷卻至室溫后，以32000 r/min 高速剪切混合2 min，之后12000 r/min 剪切1.5 h，然后真空冷凍干燥、研磨過100 目篩處理即得。預糊化淀粉的制備方法采用上述CS-LP 的制備方法，制備過程中不添加枸杞。物理混合物按照枸杞粉與預糊化淀粉的設定質量比稱重，置于EP 管中并充分混合即得。

1.2.4 LP 含量和包埋率的測定 LP 中的主要成分為類胡蘿卜素，本實驗對LP 含量的測定以β-胡蘿卜素為測定指標，測定方法參考Yazdani 等[15]并稍作修改。簡言之，于波長λ=450 nm 處測定不同濃度β-胡蘿卜素（0～100 μg/mL）的吸光值，以β-胡蘿卜素濃度為X 軸，吸光值為Y 軸繪制的標準曲線為y=0.2366x-0.0032，R2=0.9993。LP 含量測定參考李小玉等[16]的方法，分別稱取0.2 g LB 和CS-LB 溶于9 mL 蒸餾水中，靜置15 min 后于6000 r/min 條件下離心5 min，棄上清液，后向沉淀中加入提取溶劑（石油醚:丙酮=1:1），充分振蕩后超聲提取15 min，反復3 次，收集上清液并用提取溶劑定容至50 mL，于450 nm 處測定吸光值，并按式（1）計算LP 的含量，按式（2）計算CS-LB 中LP 的包埋率。

式中：X，β-胡蘿卜素含量，mg/g；C，β-胡蘿卜素濃度，μg/mL；V，定容體積，mL；M，CS-LB 質量，g；R，LP 的包埋率，%；X1，CS-LB 中β-胡蘿卜素含量，mg/g；X2，所添加LB 中的β-胡蘿卜素總含量，mg/g。

1.2.5 CS-LB 的理化性質表征

1.2.5.1 掃描電子顯微鏡分析（SEM）將微量樣品用導電膠固定在樣品板上鍍金膜，加速電壓設為6 kV[17]，放大1000 倍觀察樣品的微觀形貌。

1.2.5.2 X-射線衍射分析（XRD）取樣品粉末放置鋁片孔中，選用波長為541 nm 的單色Cu-Kα射線，設置電壓為40 kV、電流為40 mA、起始角為3°、終止角為60°進行掃描[18]。

1.2.5.3 紅外光譜分析（FT-IR）精確稱取1.0 mg樣品與100.0 mg 溴化鉀混合，壓片后進行光譜采集，空氣背景做空白對照。

1.2.5.4 熱重分析（TGA）精確稱取10.0 mg 樣品于坩堝中，起始、結束溫度分別設置為25 ℃、600 ℃，升溫速率為10 ℃/min 進行熱重分析。

1.2.6 CS-LB 穩定性實驗 CS-LB 穩定性實驗參照李素云等[19]的方法，并稍作修改，LP 保留率按式（3）計算：

式中：X3為測定時CS-LP 中LP 的含量，mg/g；X4為CS-LP 中LP 的初始含量，mg/g。

1.2.6.1 溫度對CS-LB 穩定性的影響 稱取1.0 g樣品，用透明袋真空包裝，分別置于冷藏條件（4 ℃）、常溫條件（25 ℃）、高溫條件（50 ℃）下避光保存，于第0、2、4、8、12 d 取出部分測定LP 的含量。

1.2.6.2 氧氣對CS-LB 穩定性的影響 稱取1.0 g樣品，常溫條件下分別置于密封和敞口棕色瓶中保存，隔天取樣測定LP 含量，分析兩種條件下的LP 保留率。

1.2.6.3 光照對CS-LB 穩定性的影響 稱取1.0 g樣品，常溫條件下分別置于黑暗和光照環境中保存，隔天取樣測定LP 含量，分析兩種條件下的LP 保留率。

1.3 數據處理

結果以平均值±標準差（X±SD）的形式表示，實驗均重復測定3 次，采用SPSS 13.0 統計軟件對測量結果進行統計學分析，Origin 2022 作圖。顯著性分析采用鄧肯氏多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 制備條件對CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影響

2.1.1 高速剪切時間對CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影響 圖1 為高速剪切時間對CS-LB 中LP 含量及包埋率的影響。由圖1 可知，當剪切時間由0.5 h 延長至1.5 h 時，CS-LB 中LP 含量與包埋率均呈現平穩上升的趨勢，在1.5 h 達到峰值，此時LP 含量和包埋率分別為1.060±0.004 mg/g、83.10%±0.33%；當剪切時間延長至3 h 時，LP 含量和包埋率均呈現下降的趨勢。這可能是由于在剪切力的作用下，淀粉雙螺旋結構被進一步破壞，單螺旋空腔的比例上升。同時，高速剪切處理使得枸杞細胞中的生物活性物質充分釋放出來。枸杞中的疏水性物質可通過非共價作用進入直鏈淀粉的螺旋空腔中形成復合物[20]。然而，隨著高速剪切的持續進行，可能是由于CS-LB 的結構發生破壞，導致復合物的包埋率降低，因此選擇制備CS-LB 的較優剪切時間為1.5 h。

圖1 高速剪切時間對淀粉-枸杞復合物中枸杞色素含量及包埋率的影響Fig.1 Effect of shear time on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.1.2 高速剪切速率對CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影響 圖2 為高速剪切速率對CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影響。由圖2 可知，LP 的含量與包埋率的變化呈現類似的趨勢，均先增后減。當剪切速率開始由8000 r/min 升高時，CS-LB 中LP 的含量及包埋率迅速上升，并在12000 r/min 時達到峰值，此時LP 含量和包埋率分別為1.02±0.01 mg/g，80.44%±0.92%。當剪切速率繼續升高時，LP 含量和包埋率呈顯著下降的趨勢（P＜0.05）。因此，當剪切速率為12000 r/min 時，可較好地制備CS-LB。

圖2 高速剪切速率對淀粉-枸杞復合物中LP 含量及包埋率的影響Fig.2 Effect of rotation rate on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.1.3 枸杞/淀粉質量比對LP 含量及包埋率的影響

圖3 為LB/CS 質量比（g/g）對LP 含量及包埋率的影響。由圖3 可知，當LB 和CS 質量比在1:3到3:1 范圍內，LP 的含量隨CS 和LB 質量比的增加呈遞增趨勢，在LB 與CS 質量比為3:1 時，復合物中LP 含量最高0.99±0.03 mg/g，因此選擇LB 和CS 質量比3:1 作為較優的制備比例。

圖3 枸杞和淀粉質量比（g/g）對淀粉-枸杞復合物中LP 含量及包埋率的影響Fig.3 Effect of mass proportion (g/g) of Lycium barbarum to starch on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.2 CS-LB 的理化性質表征

2.2.1 掃描電鏡分析（SEM）圖4 為玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和淀粉-枸杞復合物的掃描電鏡照片。從圖4 可以觀察到，CS 的構型呈多面體結構，大小不一，表面光滑，平均粒徑約7 μm（圖4A）。預糊化淀粉整體呈不規則片狀，與王娜等[21]制備的預糊化淀粉形態類似，這可能是由于加熱糊化破壞了CS 的結晶區域，直鏈淀粉擴展并形成了密集的網狀結構（圖4B）。枸杞粉呈團聚狀，表面凹凸不平，大小不均，形態各異（圖4C）。物理混合物可見枸杞粉和預糊化淀粉兩種物質形態的存在，說明二者僅通過物理作用聚集（圖4D）。CS-LB（圖4E）表面分布小孔，顆粒大小近似，相較于預糊化淀粉體積變大，并伴有團聚現象的發生。另外，與物理混合物相比，包合物的表面平整度降低，其形態也發生了明顯變化，由此可知LB 中的疏水性活性物質在高速剪切過程中與淀粉發生了包合絡結作用[22]。

圖4 玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞復合物的SEM 圖（1000×）Fig.4 SEM micrographs of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex (1000×)

2.2.2 X 射線衍射（XRD）分析結果 圖5 為玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LB 復合物的X 射線衍射圖。由圖5 可知，CS 在2θ為15.0°，17.0°，18.0°，23.5°處出現尖峰衍射，這是典型的A 型淀粉結晶的特征（圖5a）。預糊化淀粉（圖5b）相較于CS 衍射峰減弱或消失。當2θ為20.1°有較弱的衍射峰存在，這是由于CS 在加熱作用下不斷吸水溶脹導致其有序分子崩解并溶解，從而破壞了CS 的晶體結構[23]。枸杞粉呈無定型結構（圖5c），物理混合物（圖5d）未出現衍射峰，屬于非結晶結構。而CS-LB（圖5e）在2θ為18°、20°處出現V 型淀粉的特征衍射峰[24]，這說明CS 與枸杞粉高速剪切后促使淀粉晶型發生了由A 型向V 型的轉變，且相對結晶度有所下降。這可能與直鏈淀粉的單螺旋空腔與LB 中的活性物質有關，Lee 等[25]報道稱β-胡蘿卜素可通過范德華力，疏水相互作用與CS 作用形成復合物；Zhao 等[26]通過使用多糖可與淀粉通過氫鍵，范德華力等非共價作用結合并形成V 型復合物；同時，多酚也具有類似的效果[27]。因此，直鏈淀粉和LB 中的活性物質結合形成CS-LB。

圖5 玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞復合物的X 射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction images of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex

2.2.3 FT-IR 分析結果 圖6 為CS、預糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LB 復合物的FT-IR 圖譜。由圖6 可知，LB 在包合前后代表各基團的吸收峰并未增加或減少，表明高速剪切處理不會對LP 的分子基團造成破壞（圖6c 和圖6e）。CS 在3421 cm-1處為羥基O-H 伸縮振動吸收峰，2925 cm-1處為飽和的C-H 伸縮振動吸收峰，1647 cm-1處為結合水的伸縮振動吸收峰[28]（圖6a）。CS 與LB 粉的物理混合物在3421 cm-1處的O-H 吸收峰，以及1647 cm-1處的結合水吸收峰均變寬，且峰強變大，這是由于CS與LB 活性物質中O-H 吸收峰的締合疊加造成的[29]（圖6d）。與物理混合物相比，CS-LB 的3421 cm-1處吸收峰變強，且向高頻處發生偏移。同時，1647 cm-1處的吸收峰變強。這可能是由于CS 與客體分子包結絡合后，主客體通過氫鍵結合（圖6e）。這表明形成的CS-LB 是以非共價鍵偶聯結合的形式存在[30]。

圖6 玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞復合物的FTIR 圖Fig.6 FTIR diagram of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex

2.2.4 熱重分析結果（TGA）圖7 為CS、預糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LP 復合物的熱重分析圖。由圖7 可知，CS（圖7a）的熱損失分為兩個階段，第一階段（50～100 ℃）主要與CS 中水分揮發有關，第二階段（254～340 ℃）主要是CS 的分解，在此階段CS 分子鍵發生斷裂和碳化[31]。LB 粉（圖7c）熱損失也表現為兩個階段，第一階段（50～100 ℃）是由于自由水的揮發，第二階段的熱損失主要是在高溫條件下LB 活性物質發生分解（304～314 ℃）。CSLB（圖7e）熱損失分為三個階段：第一階段為水分的散失（50～100 ℃），第二階段為外部CS 的部分碳化與所包含的LB 活性物質的部分分解（138～209 ℃），第三階段為CS 的碳化與LP 的完全分解（221～372 ℃），CS-LB 的質量保留率為36%，高于物理混合物（圖7d），這可能是由于CS-LB 中螺旋空腔與LB 活性物質通過非共價鍵締合形成的結構更為穩定，在一定程度上提高了LB 活性物質的熱穩定性[32]。

圖7 玉米淀粉、預糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞復合物的熱重分析圖Fig.7 TGA analysis of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,and starch-Lycium barbarum complex

2.3 CS-LB 的穩定性分析

2.3.1 溫度對CS-LB 中LP 穩定性的影響 圖8A為不同溫度下包合前后的LP 保留率隨保存時間的變化趨勢圖。由圖8A 可知，環境溫度越高，保存時間越長，LP 的保留率越低，而在同一溫度下，CSLB 中的LP 保留率均高于LB 粉。其中，第12 d 時50 ℃條件下LB 粉的保留率僅為26.64%，而CSLB 中LP 的保留率為85.62%。原因在于高溫會對LP 造成不可逆損傷，且當溫度升高，時間延長，損傷越嚴重。CS-LB 中的LP 由于CS 的保護作用，降解速率減緩，且受高溫影響作用降低，熱穩定性明顯提高。劉樹興等[33]研究的淀粉-姜黃色素復合物也可改善姜黃色素的熱穩定性，本實驗結果與之相似。

圖8 不同條件對淀粉-枸杞復合物穩定性的影響Fig.8 Stable property of starch-Lycium barbarum complex under different conditions

2.3.2 氧氣對CS-LB 中LP 穩定性的影響 圖8B為氧氣對LP 穩定性的影響。由圖8B 可知，在有氧或無氧條件下，CS-LB 中LP 的保留率均高于LB粉，而在有氧條件下LP 保留率均低于無氧條件。第12 d 時，有氧條件下枸杞粉的LP 保留率為62.38%，而CS-LB 中LP 的保留率為91.22%，原因在于有氧條件下產生的氧自由基會掠奪化學鍵中的電子，使化學鍵失去穩定，導致LP 逐漸氧化分解[34]。而CSLB 可降低氧自由基對客體分子的破壞，保護LP，并提高其穩定性。鮑杰[35]曾探究氧氣對玫瑰花渣復合物穩定性的影響，其結果也證明復合物化可顯著提高色素的穩定性。

2.3.3 光照對CS-LB 中LP 穩定性的影響 圖8C為光照對LP 穩定性的影響。由圖8C 可知，光照下LP 的保留率相比于避光條件均較低，但無論光照與否，CS-LB 中LP 保留率均遠高于LB 粉。第12 d 時，光照條件下LB 粉的LP 保留率為54.81%，而CSLB 中LP 的保留率為91.38%，原因在于紫外光線會破壞化學鍵，降低LP 穩定性，使其活性逐漸分解[36]。而CS-LB 使紫外光線無法穿過螺旋空腔，包埋其中的LP 無法被分解，穩定性明顯提高。

3 結論

本研究采用高速剪切法制備了CS-LB，并以LP 含量和包埋率為指標，確定了較好的制備條件，當LB 和CS 質量比為3:1（g/g），剪切速率為12000 r/min，剪切時間為1.5 h，在此條件下得到CS-LB 中LP 的含量為0.99±0.03 mg/g。SEM 分析結果表明，所形成的CS-LP 與物理混合物相比，體積增大，表面粗糙程度增加；X 射線衍射分析表明，形成了V 型復合物，證明LB 中的疏水性活性物質被成功地結合在直鏈淀粉包合物的螺旋內腔中；FT-IR 分析結果表明，CS 與LB 活性成分通過非共價的形式結合形成復合物；與混合物相比，CS-LP 的熱穩定性明顯增強，可知預糊化淀粉與LB 活性成分發生了締合作用。通過穩定性實驗發現，CS-LP 在不同的溫度、氧氣以及光照條件下LP 的保留率均高于LB 粉。由此說明CS-LB 對LP 有較強的保護效果，能夠有效提高LP 的穩定性，使其更好的發揮生物活性。