基于HS-SPME-GC-MS 和化學計量學對不同產地紅棗香氣成分的分析

胡航偉，張仁堂，張楠楠，梁 辰，游新俠，孔欣欣，朱 玲，閆信想，劉云國,

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南鄭州 450064；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018；3.臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276000）

棗（Ziziphus jujubaMill.），鼠李科棗屬，是我國重要經濟果樹，栽培歷史悠久，在全球范圍內分布于熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區[1-4]。我國棗的產區主要集中于北方，包括河南、河北、山東、陜西、山西、新疆、寧夏等地。其中，新疆棗樹種植面積約44.5 萬公頃，已成為我國最大的棗果產區[5-6]。棗果因其含有豐富的營養物質，包括糖類、脂肪酸、氨基酸、礦物質、維生素、類黃酮及其糖苷類等，在日常消費中需求量很大，被視為是一種功能性食品[7-8]。據報道，棗中的多糖物質具有保肝活性和免疫調節作用；此外，棗果實還具有一定的抗氧化能力[9-10]，食用方便，深受消費者的喜愛。但由于種植區域、氣候條件、土壤環境等影響，導致棗果的品質出現明顯的不同。

香氣是評價紅棗品質的重要指標之一。目前，已經在紅棗中發現了50 多種芳香化合物。其中，乙酸、己酸、辛酸、己醛、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛和苯甲醛是紅棗中常見的香氣化合物[11-13]。當前，關于紅棗品質評價的研究，多圍繞著干制方式、包裝材料、烘烤溫度、加工過程變化等方面。Wojdy?o等[14]研究對流干燥、真空微波干燥、對流-真空微波干燥、冷凍干燥4 種方式對不同品種棗果品質的影響。結果發現，冷凍干燥、真空微波干燥處理后棗果的生物活性物質含量和感官評價得分更高。Fu 等[15]分析不同干制成熟期棗果組成成分的變化。其中，不同時期棗果的糖分、脂肪酸、有機酸和氨基酸含量差異顯著。主成分分析的結果也能對不同成熟期棗果進行很好地區分。解云等[16]采用電子鼻和電子舌技術測定紅棗中香氣和滋味成分。結果發現，電子鼻技術能夠對樣品風味物質進行很好區分。馬林界[17]以駿棗為實驗原料，比較4 種包裝方式在4 ℃和常溫貯藏條件下其香氣變化的規律。結果發現，鋁箔包裝的紅棗貯藏品質更好，4 ℃貯藏有利于棗果揮發性物質的保留。劉宇星[18]研究不同烘制方式對駿棗香氣成分的影響，發現溫度過高會引起脂肪酸過度降解，形成不良風味。值得注意的是，在60 ℃下烘制對駿棗果實品質的影響較小。由此可見，針對不同產地紅棗香氣成分差異的報道較少。頂空固相微萃取技術是一種廣泛應用于食品風味分析的非溶劑選擇性萃取方法，氣相色譜-質譜由于其通用性和較強的定性和定量評價能力，集化合物的分離、鑒定于一體，已成功應用在食品風味鑒定和香氣檢測[19]。基于此，將該技術應用到不同產地紅棗香氣成分評價是可行的。

本研究以河南新鄭、河南靈寶、陜西榆林、新疆和田、山東德州5 個產地的紅棗為實驗原料，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜技術（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）解析其揮發性風味物質的組成。應用化學計量學方法，如主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA），來深入了解風味特征的變化，篩選出區別紅棗地理來源的特征揮發物，從而實現紅棗樣品的區分。旨在為市售紅棗的品質鑒別和產地溯源提供一定的研究支撐，進一步推動棗果產業高質量發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 5 個產地分別是河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、陜西榆林大棗、新疆和田大棗、山東德州大棗，由當地銷售商提供；2-辛醇、氯化鈉 純度均＞99.5%，上海源葉生物科技有限公司。

65 μm PDMS/DVB 頂空固相微萃取頭 美國Supelco 公司；TSQ 8000 三重四級桿氣相色譜質譜聯用儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取 棗果揮發性化合物的提取，使用手動頂空固相微萃取裝置進行，參考Liu 等[20]的方法，稍作修改。切分、去核后的棗果，經高速破碎機處理，準確稱取2 g 粉碎后的棗果樣品置于20 mL頂空瓶，加入2 mL 飽和氯化鈉溶液、2 μL 2-辛醇（1 mg/mL，內標物）后密封。在50 ℃恒溫水浴條件下平衡40 min，隨后，插入65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭富集30 min。萃取后，將進樣針插入氣相色譜質譜儀的進樣口，并于250 ℃下解吸5 min。

1.2.2 氣相色譜-質譜條件 以氦氣（純度＞99.99%）作為載氣，流速1 mL/min，采用不分流模式。待分析物通過DB-5MS 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）實現揮發性化合物的分離。程序升溫條件為：GC 色譜初始柱溫40 ℃，保持3 min；接著，以4 ℃/min 線性升高到120 ℃，再以6 ℃/min 線性升高到240 ℃，并保持5 min。

質譜數據在EI 電離源、電子能量70 eV 的模式下獲得，掃描范圍35～550 m/z。離子源和四極桿溫度分別230、250 ℃。

1.2.3 化合物的定性與定量 揮發性化合物的鑒定是基于與NIST 2014 文庫中純標準品的質譜和保留時間的比較來確定的。本研究選取香氣成分的相似度≥80%進行分析，以2-辛醇作為內標物（濃度為1 mg/mL），棗果中揮發性香氣物質的含量計算公式如下：

1.3 數據處理

樣品的每組實驗重復測試3 次，結果用平均值±標準差來表示。通過SPSS 24 進行單因素方差分析，并通過鄧肯多重檢驗來表示組間顯著性差異（P＜0.05）。結合PCA、OPLS-DA，對不同產地紅棗的香氣物質進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地紅棗揮發性風味物質分析

由表1 可知，5 個產地紅棗樣品中共鑒定出51 種化合物，包括8 種醇類、12 種酯類、14 種醛類、3 種酸類、5 種酮類、6 種烷烴類、1 種烯烴類和2 種其他類。其中，醛類、酯類和醇類化合物在紅棗中更為豐富。不同產地紅棗樣品中揮發性風味物質的組成和含量存在明顯差異，其中，陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗分別鑒定出24 種、19 種、17 種、25 種、34 種揮發物。

表1 不同產地紅棗揮發性風味物質Table 1 Volatile flavor substances of jujube from different origins

酯類，與水果味特性有關，多是通過醇類和有機酸的非酶酯化形成的[21-22]。它們中多數以甲酯的形式存在，在不同產地紅棗樣品中公有的酯類化合物有2 種，分別是己酸甲酯（62.43～220.07 μg/kg）、庚酸甲酯（15.09～125.14 μg/kg）。另外，癸酸甲酯被報道對灰棗的香氣有重要貢獻[23]。醇類多是由葡萄糖代謝、氨基酸脫羧或多不飽和脂肪酸氧化降解形成的[24]，通常呈現果香味和花香味。在陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗中分別含有5 種、3 種、2 種、3 種、4 種。其中，1-辛烯-3-醇賦予棗果脂肪味、花香味和蘑菇味，且在河南新鄭大棗中含量最高（124.66 μg/kg），它可能是由于脂肪酸氧化產生的[25]。值得注意的是，反式-2-癸烯醇、十六醇是新疆和田大棗中特有的醇類，而2-乙基-1-癸醇、2-乙基己醇和2-甲氧基乙醇是陜西榆林大棗中所特有的醇類。醛類被認為可能是由于芳香前體的氧化降解產生，如脂肪酸水解、糖苷水解和美拉德反應[26]。在陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗中分別含有10 種、6 種、7 種、8 種、11 種。其中，苯甲醛呈現出苦杏仁味、焦糖味、麥芽味的香氣特征；（E）-2-辛烯醛呈現堅果味、脂肪味。這些揮發性化合物在紅棗的香氣呈現中起著重要作用。有研究表明，（E）-2-己烯醛和苯甲醛被認為是紅棗中的主要香氣活性物質，盡管苯甲醛的含量較低，但是發揮了香氣疊加或協同作用，使紅棗的整體香氣更容易被感知[27]。通常來說，酮類化合物多是由還原糖和氨基酸降解或不飽和脂肪酸氧化產生的[28]。特別是，新疆和田大棗中酮類的含量最高。從紅棗樣品中，共檢測到酸類化合物3 種，其中，乙酸的含量最為豐富。低分子質量的羧酸有助于棗果的酸味及刺激性氣味[29]，尤其是乙酸，對于紅棗的香氣貢獻較大，這與張富縣等[30]報道的結果是相似的。

2.2 不同產地紅棗化學計量學分析及差異揮發性化合物的確定

PCA 是一種簡化數據分析的方法，通過正交變換將多個變量轉化為少數綜合變量，以代表原始變量的信息，該方法可以有效地識別數據中“占主導地位”的元素和結構，消除噪聲和冗余，降低原始復雜數據的維數，從而更好地揭示復雜數據背后的簡單結構[31-34]。如圖1 所示，可以直觀地顯示不同產地紅棗風味物質的差異，當樣本之間的距離越近時，差異性越小，而距離越遠，則差異性越大。根據PCA 得分圖上樣品各點的離散度和聚集分布，可以看出新疆和田大棗（HT）、陜西榆林大棗（YL）分別位于PC1和PC2 正向、PC1 和PC2 反向，表明其揮發性物質的整體差異較大。同時，前兩個PC 的累積貢獻率達70.5%（PC1 的貢獻率44.9%，PC2 的貢獻率25.6%），證明該結果是可靠的。為進一步驗證結論的準確性，本研究以鑒定出的51 種揮發性風味物質為自變量（X），以不同產地為因變量（Y）進行OPLS-DA 模型分析。得到模型的自變量擬合指數R2X（cum）值為0.988，因變量擬合指數R2Y（cum）值為0.983，模型預測指標Q2（cum）為0.963，表明該模型的結果是可靠的。從圖2 可以看出，不同產地的紅棗樣品被成功地區分開，該模型結果與PCA 分析基本一致。其中，河南靈寶大棗（LB）位于t[1]反向和t[2]正向區域，新疆和田大棗（HT）位于t[1]和t[2]反向區域，陜西榆林大棗（YL）位于t[1]正向和t[2]反向區域，山東德州大棗（DZ）位于t[1]和t[2]正向區域。而河南新鄭大棗（XZ）的3 次平行樣品之間分散程度明顯，并距離陜西榆林大棗（YL）樣品較近，說明兩樣品之間的香氣成分較為相似。

圖1 不同產地紅棗揮發性風味物質主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile flavor substances in jujube from different origins

圖2 不同產地紅棗揮發性物質正交偏最小二乘判別分析Fig.2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis of volatile substances in jujube from different origins

在同時滿足預測變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）＞1.0，P＜0.05 的條件下，從不同產地鑒定的揮發性有機物中，共篩選出13 種差異揮發物（見表2），包括己酸甲酯、庚醛、庚酸甲酯等，這些化合物賦予紅棗獨特的脂肪味、柑橘味、甜味等。根據篩選出的差異揮發性物質，繪制出不同產地紅棗的PCA 載荷圖（見圖3）。前兩個PC 的累積貢獻率為71.1%，其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛位于PC1 正向和PC2 反向區域，與河南靈寶大棗（LB）的相關性較高；1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯位于PC1 反向和PC2 正向區域，與山東德州大棗（DZ）、河南新鄭大棗（XZ）的相關性較高；2-甲氧基乙醇、乙酸位于PC1 和PC2 反向區域，與陜西榆林大棗（YL）的相關性較高；壬醛、庚醛、庚酸甲酯、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛位于PC1 和PC2 正向區域，與新疆和田大棗（HT）的相關性較高。綜上，1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯可作為山東德州大棗（DZ）、河南新鄭大棗（XZ）的特征標記物，賦予棗果獨特的蘑菇味、水果味、甜味；4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作為河南靈寶大棗（LB）的特征標記物，賦予棗果獨特的杏仁味、焦糖味和青草味。

圖3 不同產地紅棗差異揮發性物質的載荷圖Fig.3 Load diagram of differential volatiles of jujube from different origins

表2 紅棗中差異揮發性化合物及香氣特征描述Table 2 Description of differential volatile compounds and aroma characteristics in red jujube

3 結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 結合化學計量學方法，對5 個不同產地紅棗揮發性香氣成分進行了全面分析。在紅棗樣品中共鑒定出51 種化合物，其中醛類、酯類和醇類是主要的揮發物。同時，在不同產地的紅棗樣品中也存在著各自特有的香氣成分，如反式-2-癸烯醛僅在陜西榆林大棗中檢測到，而戊酸甲酯僅在新疆和田大棗中檢測到。通過化學計量學分析，篩選出13 種差異風味物質（VIP＞1，P＜0.05），賦予紅棗濃郁的柑橘味、甜味、水果味等香氣特征。其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作為河南靈寶大棗的特征標記物，而乙酸、2-甲氧基乙醇可作為陜西榆林大棗的特征標記物。這些結果揭示了5 個不同產地紅棗的揮發物組成和香氣特征，為紅棗的產地溯源和鑒定提供了有力的依據。