氣相色譜法測定魚肉中指示性多氯聯苯的不確定度評定

楊冉冉，左惠君，王忠一，都 蕓，鮑治成，周雁楠，王開宇

（煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺 264000）

多氯聯苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）分子通式為：C12Hn+mCl10-n-m，其中n，m=0～5，是最具代表性的一類持久性有機污染物，擁有209 個同系物和異構體[1-3]，已于2001 年被列入聯合國環境規劃署12 種持久性有機污染物之列[4-5]。PCBs 具有難降解性、遠距離遷移性、生物蓄積性、致癌、致畸、致突變等特性，對人類健康產生極大的危害[6-8]。近年來，我國對水產動物及其制品中關于多氯聯苯的限量要求更加嚴格[9-10]，因此對檢測方法的準確度提出了更高的要求。不確定度是與測量結果聯系緊密的參數，是判定測量結果準確度的重要依據[11-14]。為了檢驗結果具有更高的可信度，對不確定度的評定受到各行業的關注[15-17]。

目前，有一些評定多氯聯苯測量不確定度的示例[18-21]。但存在以下不足：未能正確識別出“被測量”，僅評定多氯聯苯中一種成分的測量不確定度，而不是樣品中7 種多氯聯苯成分含量之和的不確定度；能識別出正確的“被測量”，但未能根據測量標準建立正確的測量模型，僅分別評定7 種成分單獨含量的測量不確定度，然后將7 種成分的不確定度簡單合成；未考慮內標定量方法的特點，未能正確分析內標法測量的不確定度分量。

現以魚肉質控樣品為例，根據內標定量方法的特點，按照JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[22]重新建立多氯聯苯測量模型，評定多氯聯苯含量（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計）的測量不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚肉質控樣品（肉泥狀）購買于廣州譜恩公司；正己烷、二氯甲烷 農殘級，Honeywell 公司；濃硫酸優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司；堿性氧化鋁固相萃取柱 深圳逗點生物技術有限公司；PCBs 混合標準品（10 μg/mL）CATO 公司；PCB198標準品（99 μg/mL）BePure 公司。

氣相色譜儀（配電子捕獲檢測器及Open LAB CDS 數據處理系統）美國安捷倫公司；SHAIII/C 型水浴恒溫振蕩器 北京況勝實業發展有限公司；SF-FDL-550 型離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；Multi Reax 型多位試管渦旋振蕩器 德國heidolph 公司；R300 型旋轉蒸發儀 步琦實驗室設備貿易（上海）有限公司；N-EVAP112（8125）型氮吹儀 美國Organomation 公司；BSA223S-CW 型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

依據方法GB 5009.190-2014《食品安全國家標準食品中指示性多氯聯苯的測定》中第二法氣相色譜法[23]。原理為在試樣中加入PCB198 內標，水浴加熱振蕩提取后，經硫酸處理、色譜柱層析凈化后，采用氣相色譜-電子捕獲檢測器法測定。根據GB 2762-2022《食品安全國家標準食品中污染物限量》，多氯聯苯含量以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計。

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 多氯聯苯混合標準中間液 準確移取1.0 mL多氯聯苯混合標準品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得濃度為400 μg/L 的多氯聯苯混合標準中間液。

1.2.1.2 多氯聯苯內標（PCB198）中間液 移取1.0 mL PCB198 標準品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得濃度為396 μg/L 多氯聯苯內標中間液。

1.2.1.3 多氯聯苯混合標準溶液系列 分別準確移取12.5、50、100、250、500 μL 多氯聯苯混合標準中間液于氣相進樣瓶中，加入100 μL 濃度為396 μg/L的PCB198 內標中間液，加正己烷補至1 mL，混勻，即得PCBs 濃度分別為5、20、40、100、200 μg/L，內標濃度為39.6 μg/L 的系列標準溶液。

1.2.2 樣品處理 準確稱取5.0 g 試樣，加入100 μL內標中間液，加入30 mL 二氯甲烷＋正己烷（50+50）溶液振搖，于恒溫水浴振蕩儀中振蕩。離心取上清液，殘渣加3×10 mL 的正己烷，振蕩后離心取上清液。合并上清液于茄形瓶中，旋轉蒸發至近干。將濃縮的提取液轉移至10 mL 試管中，用約5 mL 正己烷洗滌茄形瓶3～4 次，洗液并入濃縮液中，正己烷定容至10 mL，并加入1 mL 濃硫酸，振搖1 min，以3000 r/min 的轉速離心5 min，使硫酸層與有機層分離。重復操作，直至上層溶液呈無色。15 mL 正己烷預淋洗堿性氧化鋁固相萃取柱。將上清液轉移至小柱上，當液面降至無水硫酸鈉層時，加入30 mL 正己烷（3×10 mL）洗脫；當液面降至無水硫酸鈉層時，用25 mL 二氯甲烷+正己烷（5+95）分三次洗脫。洗脫液旋轉蒸發濃縮至近干。將上述試樣溶液轉移至進樣瓶中，用少量正己烷洗茄形瓶3～4 次，洗液并入進樣瓶中，定容至1 mL，待GC 分析。

1.2.3 多氯聯苯的上機測定 色譜柱：Agilent HP-5（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；升溫程序：120 ℃，保持3 min；15 ℃/min 升至160 ℃，保持5 min；2.5 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min；20 ℃/min 升至270 ℃，保持5 min；進樣量：1 μL；模式：不分流；進樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：300 ℃；流速：1.5 mL/min。

氣相色譜穩定后，混合標準溶液系列和樣品溶液進樣檢測，每份溶液進樣1 次。保留時間定性，內標—標準曲線法定量。

2 結果與分析

2.1 樣品測量結果

樣品溶液目標物濃度采用標準曲線—內標法定量。用安捷倫Open LAB CDS 軟件分析檢測數據，輸入多氯聯苯系列標準溶液目標物濃度及內標濃度，軟件根據目標物和內標峰面積檢測數據及輸入的目標物濃度和內標濃度自動計算標準曲線；輸入樣品溶液中內標濃度，軟件根據樣品峰面積檢測數據和內標濃度，用標準曲線直接計算出樣品溶液中目標物的濃度，目標物濃度測量結果見表1。根據式（1）、式（2）計算各樣品中多氯聯苯含量，結果見表1 。

表1 樣品測量結果Table 1 Results of sample measurement

式中，cj為樣品溶液中某一種目標物濃度，μg/L；V 為樣品處理定容體積，mL；m 為樣品質量，g；Xj為樣品中某一種目標物含量，μg/kg；XPCBs為樣品中七種多氯聯苯含量，μg/kg。

2.2 測量模型和不確定度分析

2.2.1 建立測量數據 式（1）、式（2）并不是多氯聯苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 含量之和計）的測量模型，不能據此評定多氯聯苯含量的不確定度。

根據內標定量法原理，樣品溶液目標物濃度：

代入式（2）得：

簡化得：

式（4）為多氯聯苯（以PCB28、PCB52、PCB 101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180 含量之和計）的測量模型。

式中：ci：樣品溶液中內標濃度，μg/L；cjR：樣品溶液中目標物濃度與內標濃度比值，無單位，根據標準曲線校正；∑cjR：樣品溶液中7 種目標物濃度比值之和，無單位。

2.2.2 測量不確定度分析 根據內標法校正原理，系列標準溶液和樣品中加入同一份內標中間液，樣品測量結果與樣品定容體積V 無關；與內標中間液濃度無關，但與加入樣品中的內標中間液體積Vi有關，則不確定度的模型為：

其中，∑cjR做為測量模型中一個獨立的乘積因子，由7 種目標物濃度比值的不確定度合成；每種目標物濃度比值由目標物標準溶液不確定度和標準曲線擬合不確定度引入。根據內標法校正原理，由標準溶液系列引入的不確定度也與標準溶液定容體積及內標中間液濃度無關，無須評定其不確定度，但要評定加入內標中間液體積不確定度。按照JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》要求，魚肉中多氯聯苯測量不確定度因果圖見圖1。

圖1 多氯聯苯含量總和測量不確定度因果圖Fig.1 Causal graph of uncertainty in the measurement of the sum of PCBS

2.3 測量不確定度評定

根據測量模型式（4）及不確定度模型式（5），需要根據標準曲線、樣品溶液峰面積比值計算出樣品溶液中目標物濃度與內標濃度的比值。樣品溶液中各目標物與內標濃度之比值見表2。根據式（4）計算樣品中多氯聯苯含量，及相關數據平均值，計算結果見表2。

表2 樣品測試液中目標物濃度與內標濃度比值及多氯聯苯含量計算結果Table 2 Ratio of target concentration to internal standard concentration and the calculation of PCBS content in sample test solution

2.3.1 測量重復性不確定度 測量重復性不確定度是測量結果平均值的標準偏差，采用A 類評定，為A 類標準不確定度[24]。根據表2，6 次測量的標準偏差：

A 類標準不確定度：

A 類相對標準不確定度：

2.3.2 樣品質量不確定度 樣品質量m=4.793 g，使用0.001 g 電子天平。天平檢定合格，檢定證書顯示天平示值誤差E=3 mg，重復性m重=2 mg 天平分辯率d=1 mg。質量稱量兩次，因質量較小，質量不確定度僅由天平重復性引入[25]。根據JJG 1036-2008《電子天平檢定規程》[26]，天平重復性為6 次檢定稱量質量的極差，按極差法求得重復性標準偏差，6 次極差系數C=2.53，則稱量質量m 的不確定度：

相對不確定度：

2.3.3 樣品中加入內標使用液體積Vi的不確定度樣品和標準溶液中加入同一份內標中間液，同一支移液槍吸取相同體積100 μL，內標中間液體積不確定度由移液槍測量重復性引入，與移液槍容量允差無關。實驗室溫度在22～23 ℃，溫度較為穩定，可忽略溫度波動引入的不確定度。查移液槍檢定證書，100 μL 測量重復性為0.2%，可直接引用，ur（Vi）=ur（Vsi）=0.2%=0.002。

2.3.4 樣品溶液中7 種目標物濃度比值之和 ∑cjR的不確定度 ∑ cjR做為乘積測量模型（4）、（5）中一個因子，需要單獨評定其相對不確定度。∑ cjR是樣品溶液中7 種目標物濃度與內標濃度比值的總和；每種目標物濃度比值不確定度由目標物標準溶液不確定度和標準曲線擬合不確定度引入。

2.3.4.1 多氯聯苯中間液（cS中=400 μg/L）的不確定度 量取1.00 mL 多氯聯苯儲備液，正己烷定容于25 mL，制得濃度為400 μg/L 的多氯聯苯混合標準中間液。不確定度由儲備液、量取體積、定容體積引入。

a.查標準品證書得PCBs 混合標準品相對擴展不確定度為±3%（k=2），相對不確定度為：

b.吸取多氯聯苯儲備液體積

1 mL A 級單標吸量管容量允差為±0.007 mL[27]，按三角分布k 為計算得不確定度為：

標準儲備溶液20 ℃定標，溶劑異辛烷膨脹系數為β=1.14×10-3[2]，實驗室溫度在22～23 ℃，溫度差異以最大值3 ℃計，按均勻分布假設，，則溫度引入的不確定度為：

合成得：

c.定容于A 級25 mL 容量瓶，容量允差為±0.03 mL，按三角分布k 為計算得相對不確定度：

d.合成得多氯聯苯中間液（CS中=400μg/L）的相對不確定度：

2.3.4.2 多氯聯苯混合標準溶液系列的不確定度多氯聯苯混合標準溶液系列配制由多氯聯苯標準中間液及吸取體積，內標中間液及吸取體積以及定容體積決定。不確定度由多氯聯苯標準中間液濃度及吸取體積、吸取內標中間液體積引入，與定容體積和內標中間液濃度無關。

a.吸取體積用100 μL/500 μL 移液槍，體積不確定度由允差和溫度引入。查檢定證書，吸取體積12.5 μL 時容量允差為0.9%，吸取體積50 μL 時容量允差為0.6%，吸取體積100 μL 時容量允差為0.3%，吸取體積200 μL 時容量允差為0.3%，吸取體積500 μL 時容量允差為±0.2%。按均勻分布處理為容量允差的不確定度：

溫度不確定度，配制標準溶液系列與配制中間液溫度基本相同，溫度不確定度僅由移液槍體脹系數[28]引入，代入如下：

b.吸取內標中間液體積不確定度，同2.3.3。

c.系列標液各濃度比值的相對不確定度：

根據移液槍檢定證書和使用體積，計算各吸取體積的不確定度和各濃度比值的相對不確定度，結果見表3。

表3 混合標準系列溶液的不確定度評定Table 3 Uncertainty of mixed standard series solution

d.標準溶液系列相對不確定度以各濃度比值相對不確定度的均方根表示：

7 種多氯聯苯目標物濃度比值的相對不確定度相同。

2.3.4.3 標準曲線擬合引入的不確定度 標準曲線的殘留偏差結果見表4，計算方式如下：

表4 標準溶液系列測量數據Table 4 Standard solution series measurement data

曲線擬合引入的不確定度：

式中：SR：標準曲線的殘留偏差；a：標準曲線的斜率；P：樣品溶液的測量次數，P=1；N：標準溶液總測量次數，N=5×1=5；：濃度比值平均值，：各濃度比值與均值差的平方和，

以PCB28 為例：CR28=2.248，代入式（10）得：

根據樣品溶液中各目標物濃度比值評定其由標準曲線擬合引入的不確定度，結果見表5。

表5 樣品溶液中各目標物濃度比值不確定度Table 5 Uncertainty of concentration ratio of each target in sample solution

2.3.5 評定樣品溶液中7 種目標物濃度比值之和∑cjR的不確定度

2.3.5.1 樣品溶液中各目標物濃度比值不確定度由標準溶液系列和曲線擬合合成，見表5。其中標準溶液系列引入的不確定度由樣品溶液中各目標物濃度比值與標準系列相對不確定度相乘得到。

2.3.5.2 評定樣品溶液中7 種目標物濃度比值之和的不確定度

相對不確定度：

2.4 回收率的不確定度

2.5 合成標準不確定度

根據評定過程可知，測量重復性、樣品的稱量質量、內標的加入體積、樣品溶液中各目標物濃度比值之和四部分互相獨立，因此合成相對不確定如下：

2.6 擴展不確定度及報告

取包含因子k=2，相對擴展不確定度Ur=k×ur=2×0.0147=0.0294≈2.9%魚肉中多氯聯苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計）報告：149.1（1±2.9%）μg/kg，k=2，式中正負號后的數為相對擴展不確定度Ur的值。

各類相對不確定度主要分量及貢獻見表6。由表可知，不確定度主要來源于測量重復性和樣品溶液中各目標物濃度比值之和。

表6 各類相對不確定度主要分量及貢獻Table 6 Major components and contributions of various relative uncertainties

3 結論

內標法是將一定重量的純物質作為內標加到一定量的被分析混合物中，根據測試液和內標的含量比及其相應的峰面積面積比來計算被測試組分的含量，可以有效消除由于操作條件影響而產生的實驗誤差[30]，準確度和精密度均優于外標法[31]。本評定示例，根據內標法的特點，沒有評定內標物的濃度以及加入內標后的定容體積等引入的不確定度，僅評定加入內標體積重復性的不確定度。建立了氣相色譜標準曲線—內標法測定多個目標物之和的不確定度評定的分析方法，具有科學合理、易于評定的特點。通過評定可知，根據GB 5009.190-2014《食品安全國家標準 食品中指示性多氯聯苯的測定》第二法氣相色譜法測量魚肉樣品中指示性多氯聯苯的含量，不確定度主要來源于測量重復性和樣品溶液中各目標物濃度比值之和，在以后的實驗中，為了得到更加精確、可信的結果，應該根據需要經常維護保養氣相色譜儀使儀器保持在最佳狀態，增加平行進樣次數以及在實驗過程中嚴格按照標準規范操作。