仿野生種植三葉青不同部位總黃酮分析及其抗炎、抗氧化能力比較

汪傳寶，陳靜文，王 可，仇鳳梅，黃 真，鐘曉明,

（1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州 310053；2.嘉興學院醫學院，浙江嘉興 314001）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg），又稱金線吊葫蘆、蛇附子、石抱子、三葉對，是一種具有重要藥用價值的多年生常綠藤本植物[1]。作為一種珍貴的中草藥材，三葉青在我國分布較廣，常見于浙江、江西、福建、廣西等地，全草皆可入藥，以塊根最佳[2]。藥理研究表明，三葉青具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]等生理活性。作為浙產地道藥材，三葉青常被用于小兒高熱驚厥、痢疾、活血散結、祛風化痰等治療[7]。也有研究將三葉青添加到食用油中用作保健食品從而更有利于保留功效[8]；將鈣果和三葉青為主料加工成鈣果三葉青營養片等。三葉青的黃酮類物質被廣泛認為是其重要的藥物組成部分[9]，已有研究證實多種藥理活性與黃酮類密切相關[10-12]。目前，因為三葉青藥用價值較高，市場需求越來越大，導致三葉青市場價格突飛猛進，人們對于三葉青野生資源的過度采挖，造成其自然條件下的野生資源逐漸減少。三葉青人工種植是解決這一現狀的主要手段之一[13]。又因其藥用部位以塊根為主，種植采收后的地上部分和根須[14]極少被合理利用，存在大量的資源浪費。近年來，已有學者從三葉青塊根中分離出具有抗炎活性的物質，證實三葉青塊根具有良好的抗炎活性[15]。本文從物質基礎和功效方面比較仿野生種植三葉青不同部位間的差異，以期為仿野生種植三葉青質量控制提供參考依據，并對仿野生種植三葉青資源的合理開發利用提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青樣品 浙江麗水仿野生種植栽培基地2021 年8 月份采收，經浙江中醫藥大學藥學院資源研究所黃真教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg 的干燥全株；蘆丁（純度均＞98%）、槲皮素（純度均＞98%）、山奈酚（純度均＞98%）、1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國Tedia 公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）酷爾化學；L-抗壞血酸（VC）、脂多糖（LPS）Sigma 公司；RAW264.7 小鼠巨噬細胞 由浙江省醫學科學院惠贈；胎牛血清四季青公司；DMEM 培養基 Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液、PBS 緩沖液 Biosharp 公司；二甲基亞砜分析純，國藥集團化學試劑有限公司；NO 檢測試劑盒 碧云天；其他試劑為分析純；超純水 Milli-Q 超純水系統制備。

ME203E 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；GZX-9140MBE 數顯鼓風干燥箱 上海帥登儀器有限公司；HH-2 恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器廠；UV-1800 紫外分光光度計 杭州宗燦科技有限公司；Waters 高效液相（HPLC）色譜儀 美國Waters 公司；ELX800 酶標儀 美國博騰儀器有限公司；二氧化碳培養箱 美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺 丹麥Labogene 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三葉青不同部位總黃酮提取與含量測定

1.2.1.1 三葉青不同部位總黃酮的提取 仿野生種植三葉青莖葉、塊根、根須置于陰涼干燥處，自然干燥、粉碎、過50 目篩處理后，收集作為樣品粉末。精密稱取三葉青樣品粉末1.00 g，按照如下熱回流提取工藝進行提取，料液比1:30 g·mL-1，溫度83 ℃，提取時間65 min，乙醇濃度60%。濾液經抽濾后，用50 mL 容量瓶定容，備用[16]。

1.2.1.2 蘆丁標準曲線的繪制 參考文獻[17]并加以修改，標準品的制備：精密稱取蘆丁10.0 mg，用60%乙醇進行溶解，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻后即得。測定方法：精密吸取配制好的蘆丁對照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入到25 mL 容量瓶中，先加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min 后再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min 后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用純水定容至25 mL，混勻后靜置15 min。以純水作為空白對照，采用紫外分光光度計測量各樣品在510 nm 波長處的吸光度值，以吸光度（A）對蘆丁質量濃度（X）進行回歸，得到回歸方程：A=10.613X-0.0171（R2=0.9999）。

1.2.1.3 三葉青不同部位總黃酮的測定 精密量取三葉青試樣溶液2.0 mL，并置于25 mL 容量瓶中進行定容，按照“1.2.1.2”中所述方法操作，測定三葉青總黃酮得率，以如下公式進行計算：

式中，Y 為三葉青總黃酮得率，mg·g-1；C 為三葉青總黃酮的質量濃度，mg·mL-1；V 為三葉青提取液體積，mL；N 為稀釋倍數；M 為三葉青樣品質量，mg。

1.2.2 三葉青不同部位指標成分的含量差異測定

1.2.2.1 標準品溶液的制備 精密稱取蘆丁、山奈酚、槲皮素標準品各1.0 mg，向其中分別加入1 mL純甲醇，使其完全溶解，稀釋至1.0 mg/mL，儲存備用。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取三葉青樣品適量，粉碎后精密稱量各不同部位粉末1.0 mg，置于圓底燒瓶中，采用醇提工藝[15]進行提取，濾液用旋轉蒸發儀蒸干，用甲醇轉移并定容至5 mL 容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品。

1.2.2.3 色譜條件 采用Waters Sunfire C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸水為水相（A 相）-乙腈為有機相（B 相），梯度洗脫條件為（0～5 min，10% B；5～15 min，10%～12% B；15～30 min，12% B；30～35 min，12%～13% B；35～75 min，13%～43% B；75～90 min，43%～73% B；90～110 min，73%～100% B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.2.4 線性關系考察 精密吸取適當的混合標準品溶液配制成濃度均為100 μg/mL 的混合標準品溶液，再依次稀釋成50、20、10、5、1 μg/mL 的系列溶液，分別進樣，在360 nm 波長下測定各組分的峰面積，以峰面積對標準品濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，并測定各成分的線性范圍。

1.2.3 指紋圖譜方法學考察

1.2.3.1 精密度實驗 取同一批供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下連續進樣6 次[18]，計算得出槲皮素峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.3.2 穩定性實驗 取同一批供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定[18]，計算得出槲皮素峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.3.3 重復性實驗 取6 份供試品溶液，在“1.2.2.3”條件下進樣[18]，計算得出槲皮素峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。

1.2.4 三葉青不同部位黃酮提取物體外抗氧化能力測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除率測定 參考文獻[19]并加以改進，將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質量濃度的樣品溶液。精密量取三葉青待測液各2 mL，和含有2 mL 1×10-4mol/L 的DPPH 溶液充分搖勻后避光靜置30 min，以純水作為空白組，在517 nm 波長處測定吸光度，以VC為對照品。按下式計算清除率。

式中：Ao表示純水和DPPH 溶液的吸光值；Ax表示三葉青樣品和DPPH 溶液的吸光值；Axo表示三葉青樣品和無水乙醇的吸光值。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻[20]并加以改進，提前配制好7.4 mmol/L 的ABTS 溶液與2.6 mmol/L 的過硫酸鉀溶液1:1 混合均勻，避光靜置過夜后，制成ABTS 儲備液。實驗時用95%乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下的A 值為0.700±0.020。

將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質量濃度的樣品溶液。取0.2 mL 樣品溶液，加入0.8 mL ABTS 工作液，混勻，在室溫下避光反應10 min，空白組選擇用95%乙醇代替，在734 nm 波長下測定吸光度，以VC為對照品，按式（3）計算清除率。

式中：Ao表示95%乙醇和ABTS+溶液的吸光度；A 表示三葉青樣品和ABTS+溶液的吸光度。

1.2.4.3 羥自由基清除率測定 參考文獻[21]并加以改進，將該提取工藝下得到的三葉青不同部位配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質量濃度的樣品溶液。吸取2 mL 三葉青待測液于試管中，依次加入9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL、9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液2 mL 和9 mmol/L 的過氧化氫溶液2 mL，搖勻，在37 ℃條件下反應30 min，冷卻后于510 nm 波長處測量吸光度，以純水作為空白組，以同濃度的VC作為對照組，按式（4）計算清除率。

式中：Ao表示純水+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值；Ax表示三葉青樣品+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液的吸光值；Axo表示三葉青樣品+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液的吸光值。

1.2.4.4 鐵離子還原力測定 參考文獻[22]并加以改進，將該提取工藝下得到的不同部位三葉青樣品配制成0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL 質量濃度的樣品溶液。取1 mL 三葉青樣品于試管中，加入2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH7.4），2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液混合均勻后置于50 ℃條件下反應20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于4000 r/min 離心10 min，吸取上清液2.5 mL 于另一試管中，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（0.1%），混勻后靜置10 min，以同濃度的Vc 為對照品在700 nm 波長處測定吸光度值，吸光度值越大，說明該樣品對鐵離子的還原能力越強。

1.2.5 三葉青不同部位黃酮提取物抗炎能力測定

1.2.5.1 RAW264.7 細胞培養 將RAW 264.7 細胞培養于DMEM 完全培養基中（含10%胎牛血清），培養條件為37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞處于對數生長期后進行后續實驗。

1.2.5.2 MTT 法篩選給藥安全濃度 參考文獻[23]并加以改進，待RAW264.7 細胞密度達到70%～80%時，調整細胞密度為1×105cell/mL，吹打均勻后，接種至96 孔細胞培養板中，設置空白組，正常組和給藥組，給藥組加入100 μL/孔的25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL 系列濃度的三葉青提取物溶液，正常組不添加藥物，代之等量的培養基；空白組不接種細胞，加入等量的培養基。每組設置6 個復孔，于37 ℃，5% CO2飽和濕度環境下培養24 h后，棄去培養液，用PBS 溶液洗滌2 次，每孔加入5 mg/mL MTT 工作液100 μL，于細胞培養箱中培養4 h 后，用移液槍吸去上清液，補加150 μL DMSO溶液，震蕩溶解13 min，立即至酶標儀檢測490 nm波長下的吸光度值，實驗重復三次，按式（5）計算細胞存活率：

1.2.5.3 Griess 法測定NO 釋放量 參考文獻[23]并加以改進，待RAW264.7 細胞密度達到70%～80%時，調整細胞密度為1×105cell/mL，吹打均勻后，將細胞分為正常組、模型組、阿司匹林（Aspirin，陽性藥）組和給藥低中高組，分別接種于96 孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，模型組不加入藥物，加入等量的培養基；陽性藥組加入含阿司匹林的培養基溶液，使終濃度為100 μg/mL；給藥組添加含待測樣品的培養基溶液，分別以終濃度為50、100、200 μg/mL。每組設置3 個復孔，于37 ℃，5% CO2飽和濕度環境下培養24 h。其中模型組、陽性藥組、給藥組，在培養24 h 后，棄去原先培養基，加入200 μL 含1 μg/mL LPS 的DMEM 培養基，正常組代之等量的培養基，繼續培養24 h。待測樣品孔中加入各組培養上清液50 μL，標準品孔加入濃度0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L 各50 μL，零孔加入培養基50 μL。各孔中分別加入50 μL 的Griess Reagent Ⅰ，再加入50 μL 的Griess Reagent Ⅱ，在540 nm 波長下測定OD 值，根據試劑盒說明書計算NO 釋放量，實驗重復3 次。

1.3 數據處理

實驗數據用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行統計分析，數據均為3 次平行實驗的平均值，結果用平均值±標準偏差表示，并對實驗結果進行配對t檢驗，P＜0.05 為差異顯著；采用GraphPad Prism 8 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 三葉青不同部位總黃酮含量

2.1.1 三葉青不同部位的黃酮提取物得率比較 分別稱取三葉青莖葉，塊根，根須三個部位藥材粉末33.30 g，以最佳提取工藝提取，抽濾，旋蒸，烘干，計算提取物得率。結果顯示，莖葉的提取物得率為8.96%±0.02%；塊根的提取物得率為12.06%±0.02%；根須的提取物得率為7.23%±0.01%。

2.1.2 三葉青不同部位總黃酮含量差異 結果顯示，莖葉總黃酮含量為11.86±0.23 mg·g-1；塊根總黃酮含量為8.48±0.10 mg·g-1；根須總黃酮含量為7.52±0.02 mg·g-1。從得率和總黃酮含量比較看，莖葉部分的總黃酮含量最高，得率次于塊根部分，在資源開發方面保證了產量，這有利于后續對三葉青莖葉部分的開發利用。

2.2 三葉青不同部位總黃酮HPLC 指紋圖譜的建立

通過將三葉青色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”中，如圖1 所示，根據相同的保留時間共標定了10 個共有峰，三個部位的液相色譜圖比較，莖葉的色譜峰更多，表明成分更豐富。從出峰的強度來看，莖葉樣品的總峰面積更多，所含有的化學成分含量更多，這對三葉青莖葉化學成分進一步研究提供了參考。與混合對照品比對，指認其中三個指標成分，確認6 號峰為蘆丁，8 號峰為槲皮素，9 號峰為山奈酚，可以進一步進行含量測定。

圖1 三葉青樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度實驗 取同一批塊根樣品為供試品，連續進樣6 次，以8 號峰為參考峰，計算得出各樣品峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別為0.5%、0.9%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.2 穩定性實驗 取同一批塊根樣品為供試品，分別在配制后0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，以8 號峰為參考峰，計算得出各樣品峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別為0.1%、1.0%，表明供試品在24 h 內的穩定性良好。

2.3.3 重復性實驗 取6 份塊根樣品為供試品，分別進樣，以8 號峰為參考峰，計算得出各樣品峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別為0.5%、1.3%，表明該方法的重復性良好。

2.4 標準曲線的繪制與線性范圍的確定

通過查看各標準品在200～400 nm 下的光譜圖，發現蘆丁、槲皮素、山奈酚在360 nm 左右有較強吸收，于是對各標準品在360 nm 波長下對各峰進行積分。以標準品對應峰的峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖2 所示，線性方程分別為：蘆丁，y=878.39x-689.21，R2=0.9993；槲皮素，y=3199.5x-5555.1，R2=0.9992；山奈酚，y=3725.6x-2189.5，R2=0.9994。蘆丁，槲皮素，山奈酚均在1～100 μg/mL 范圍內呈現線性關系。

圖2 三葉青不同部位指標成分含量比較（±s，n=3）Fig.2 Comparison of contents of index components in different parts of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg（±s，n=3）

2.5 三葉青不同部位指標成分的含量差異

將三葉青的三個不同部位進行HPLC 檢測，對三個指標成分進行分析。結果表明，蘆丁，槲皮素和山奈酚在塊根樣品中含量都是最高。蘆丁含量由高到低依次為塊根（4.99 mg/kg）、根須（2.79 mg/kg）、莖葉（2.49 mg/kg）。槲皮素含量由高到低依次為塊根（30.93 mg/kg）、根須（14.75 mg/kg）、莖葉（9.59 mg/kg）。山奈酚含量由高到低依次為塊根（4.89 mg/kg）、根須（4.28 mg/kg）、莖葉（3.43 mg/kg）。從總體上看，塊根中的三種指標成分含量最多[24]，但是從總黃酮含量以及高效液相色譜圖分析，莖葉中有著更加豐富的成分，表明三葉青不同部位間各化學成分不同，各成分含量也不盡相同，這與藍艷等[25]對不同產地三葉青中化學成分測定的結果相似。可能的原因是三葉青在生長過程中化學成分富集的部位不同，且莖葉部位的成分種類更多可能跟光合作用有關，值得進一步開發利用。

2.6 三葉青不同部位體外抗氧化能力差異

2.6.1 三葉青黃酮提取物對DPPH 自由基的清除能力 由圖3 可知，隨著樣品質量濃度的增大，三葉青不同部位對DPPH 自由基的清除率逐漸提高，在質量濃度為0.8 mg/mL 時，三葉青莖葉的清除率為95.08%，IC50值為0.2107 mg/mL；塊根的清除率為91.53%，IC50值為0.3134 mg/mL；根須的清除率為94.12%，IC50值為0.2058 mg/mL。而VC對DPPH的清除率在0～0.1 mg/mL 的范圍內急劇增加，達到96.67%，此后基本維持在此水平。由此可見，三葉青提取物對DPPH 自由基具有一定的清除能力，但與Vc 相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強一些。張進軍等[26]對浙產三葉青地上部分抗氧化活性評價，測得對DPPH 自由基清除率的IC50值為0.1902 mg/mL，與本實驗所得結果相符，為仿野生種植三葉青更加全面、客觀的評價抗氧化能力提供了參考。

圖3 三葉青對DPPH 自由基清除率的影響Fig.3 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on DPPH radical

2.6.2 三葉青黃酮提取物對ABTS+自由基的清除能力 由圖4 可知，隨著質量濃度的增大，三葉青不同部位對ABTS+自由基的清除率逐漸提高，在質量濃度為0.6 mg/mL 時，三葉青莖葉的清除率為97.56%，IC50值為0.2315 mg/mL；塊根的清除率為89.64%，IC50值為0.3758 mg/mL；根須的清除率為99.91%，IC50值為0.2587 mg/mL。而VC對ABTS+自由基的清除率在0～0.1 mg/mL 的范圍內急劇增加，達到99.70%，此后基本維持在此水平。由此可見，三葉青提取物對ABTS+自由基具有一定的清除能力，但與VC相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強一些。

圖4 三葉青對ABTS+自由基清除率的影響Fig.4 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on ABTS+ radical

2.6.3 三葉青黃酮提取物對羥自由基清除能力 由圖5 可知，隨著質量濃度的增大，三葉青不同部位對羥自由基的清除率呈現上升趨勢。當濃度達到1.0 mg/mL 時，三葉青莖葉的清除率為77.50%，IC50值為0.7625 mg/mL；塊根的清除率為68.21%，IC50值為0.8967 mg/mL；根須的清除率為78.96%，IC50值為0.7856 mg/mL。而VC對羥自由基的清除率在0～0.4 mg/mL 的范圍內呈上升趨勢，在0.4 mg/mL時達到100%。由此可見，三葉青提取物對羥自由基具有一定的清除能力，但與VC相比能力較弱。且三葉青不同部位之間也有差異，莖葉和根須的清除能力較塊根強一些。

圖5 三葉青對羥自由基清除率的影響Fig.5 Scavenging effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on hydroxyl radical

2.6.4 三葉青黃酮提取物的還原能力 由圖6 可知，在測試的質量濃度范圍內，VC和三葉青的還原能力隨著濃度的升高而增強。在1.0 mg/mL 時，VC的吸光度值為0.785；三葉青莖葉、塊根、根須的吸光度值分別為0.172、0.153、0.184。雖然三葉青的還原力較VC弱，但也表現出一定的還原力，且莖葉和根須的還原能力較塊根更強。

2.7 三葉青不同部位抗炎能力測定

2.7.1 MTT 法篩選給藥安全濃度 如圖7 所示，三葉青三部位的給藥濃度在25～200 μg/mL 范圍內時，RAW264.7 細胞存活率無明顯下降，表明三葉青提取物在此濃度范圍內無細胞毒性，可作為安全給藥劑量范圍。當三葉青給藥濃度上升到400 μg/mL 時，細胞存活率顯著性下降（P＜0.05），表明此時已產生細胞毒性。故本實驗選用25～200 μg/mL 作為安全劑量濃度，用于后續實驗。

圖7 三葉青黃酮提取物對RAW264.7 細胞存活率的影響（±s，n=3）Fig.7 Effect of flavonoid extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on the viability of RAW264.7 cells（±s，n=3）

2.7.2 三葉青對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO 釋放的影響 炎癥是生物體對抗外來有害物質或損傷的防御性反應，通過釋放NO 等炎癥介質或因子對抗細菌、病毒等入侵物質，以維持機體平衡。NO 是一種獨特的內源性信號分子，參與正常生理活動；然而，炎癥反應過度爆發時，NO 會異常過量表達，導致炎癥加劇，其與多種炎癥疾病的發生和發展密切相關，通常被認為是炎癥產生的標志和用作體外抗炎藥物篩選模型[27-28]。本實驗采用LPS 刺激RAW264.7細胞產生炎癥介質NO 對待測樣品進行抗炎活性篩選，結合MTT 法所得的安全濃度影響，實驗結果表明，與正常組相比，模型組細胞NO 含量極顯著上升（P＜0.001）；與模型組相比，阿司匹林組細胞NO 釋放量極顯著性降低（P＜0.001）。三葉青不同部位各給藥組NO 釋放量呈劑量依賴性降低，均有顯著性差異（P＜0.01），三葉青三個部位提取物均可以降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO 含量，且塊根和根須樣品在濃度達到200 μg/mL 時，表現出比阿司匹林更好的抗炎活性圖8。

圖8 三葉青黃酮提取物對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響（±s，n=3）Fig.8 Effect of flavonoid extract of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg on LPS-induced NO release in RAW264.7 cells（±s，n=3）

3 討論與結論

本研究采用醇提工藝，測出的結果與吉慶勇等[29]測定的人工種植和野生三葉青地下塊莖的總黃酮含量相近，各部位之間總黃酮含量沒有顯著性差異。從指紋圖譜分析可知，三葉青莖葉中的成分更多，提示三葉青莖葉可以作為三葉青功效性部位的可能。

常用的體外抗氧化活性[30]評價包括自由基清除能力和還原能力，指在自由基溶液中加入抗氧化劑，兩者反應產生的光學變化差異來反映抗氧化活性或根據抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原，在700 nm 處有最大吸收峰。吸光值越大，表明樣品還原力越強。本實驗采用DPPH、ABTS+、羥自由基法及鐵離子還原法進行分析，三葉青三部位均具有一定的抗氧化活性，莖葉和根須的IC50值均比塊根高，顯示出三葉青莖葉和根須具有更強的抗氧化活性。

有研究報道三葉青黃酮可以通過減輕LPS 誘導的炎癥細胞滲出和促炎因子分泌達到抗炎的作用[31]，故本實驗使用LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞對三葉青不同部位進行抗炎活性研究，結果表明在安全濃度范圍內，三葉青不同部位的黃酮提取物均能使細胞培養液中的NO 含量顯著降低，這說明三葉青三部位均表現出良好的抗炎作用。

對于種植采收時拋棄的三葉青莖葉和根須而言，是一種很大的資源浪費。本實驗為仿野生種植三葉青莖葉和根須的資源開發利用提供參考依據，也為加快三葉青藥材全資源利用和食品、保健品的開發奠定基礎。