丙型肝炎病毒抗體化學發光免疫分析法 ≥ 95%陽性預測值最佳吸光度/臨界值建立方法學和重要性探討

韓金育 郭晶晶 孟 歡 陳 瑾 王雅杰,*

(1.北京大學地壇醫院教學醫院檢驗科,北京 100015;2.首都醫科大學附屬北京地壇醫院檢驗科,北京 100015)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是引起慢性肝病的主要誘因[1],部分患者可發展為肝硬化、肝細胞癌,全球約有1.6%的人口感染HCV,每年大約有40萬人死于HCV感染相關疾病,對公眾生命健康造成嚴重威脅[2]。因此,對HCV感染進行早期篩查、準確診斷尤為重要。由于HCV抗體檢測操作簡便、具有較高靈敏度等優勢,可作為實驗室HCV篩查的首選方法,然而在方法學上不可避免地容易出現假陽性,尤其是弱陽性患者,給臨床診斷造成了困擾,降低了檢驗報告的準確性。美國疾病預防控制中心[3]建議對于HCV抗體陽性的患者進行更多確證試驗來證實。重組免疫印記試驗(recombinant immunoblot assay,RIBA)因其特異度較高曾被廣泛作為HCV 抗體的補充確證試驗,但自2010年,RIBA試劑盒在美國停止生產后,不再推薦RIBA作為抗體補充確證試驗。HCV抗體陽性的患者進行HCV RNA檢測,但HCV RNA陰性并不能排除HCV感染。

丙型肝炎病毒抗體吸光度/臨界值(signal-to-cutoff,S/CO)值越高,抗體真陽性率越高[3-4],近些年的研究表明抗體S/CO值在預測病毒血癥、診斷HCV感染中具有重要價值[5],可根據最佳S/CO值來限制非必要進行補充確證試驗的人數[6]。目前,由于不同醫院及實驗室所應用的儀器試劑以及方法學不同,尚無法統一HCV抗體的診斷臨界值。基于以上所述,本研究對抗體初篩為有反應性的樣本進行確證實驗,并通過受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,得到本實驗室抗體陽性預測值 ≥ 95%的最佳S/CO值完善檢驗報告,協助臨床診斷。同時為探索不同系統丙型肝炎病毒抗體檢測試劑95%陽性置信區間建立方法學。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取2021年7月至2022年2月在首都醫科大學附屬北京地壇醫院應用雅培抗HCV抗體檢測試劑盒(chemiluminescence analysis,CLIA)進行初篩檢測同時進行HCV RNA檢測的患者血漿樣本共282例,其中男性138例、女性144例,患者年齡21～84歲,平均年齡(52.46±13.20)歲,丙型肝炎的臨床診斷符合中華醫學會肝病學分會、中華醫學會感染病學分會制訂的《丙型肝炎防治指南》2019年版[7]。納入標準:① 進行HCV抗體初篩;② 具有HCV RNA檢測結果。排除標準:① 哺乳、妊娠期婦女;② 合并人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)及其他肝炎病毒感染;③ 合并其他惡性腫瘤等疾病。該研究經首都醫科大學附屬北京地壇醫院倫理委員會批準(文件編號:DTEC-KY2022-027-01),并獲得免知情同意。

1.2 方法

1.2.1 HCV抗體檢測

采用購自美國雅培公司的ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析儀(CLIA法)對丙型肝炎病毒抗體進行初篩。

CLIA法陽性判定:按照雅培說明書進行判斷,S/CO ≥ 1為有反應性。

1.2.2 HCV RNA檢測

采用購自瑞士羅氏生物公司的cobas AmpliPrep儀器進行核酸提取,并采用購自瑞士羅氏生物公司的cobas TaqMan分析儀進行自動擴增并檢測。

HCV RNA檢測:線性范圍為15.0～1.0×108IU·mL-1,分析靈敏度為9.2 IU·mL-1。

1.2.3 RIBA 檢測

采用北京萬泰生物藥業股份有限公司生產的丙型肝炎病毒抗體確證試劑盒對丙型肝炎病毒抗體初篩為陽性的血漿樣本中的抗體進行確認。

RIBA法陽性判定:根據各條帶顯色強度判斷結果陰、陽性。至少出現兩種HCV抗體特異條帶(Core,NS3,NS4和NS5)強度1+及以上,結果判讀為陽性;未出現HCV抗體特異條帶強度1+及以上,結果判讀為陰性;僅出現一種HCV抗體特異條帶(Core,NS3,NS4和NS5) 強度1+及以上,結果判讀為不確定,詳見圖1。

圖1 RIBA結果

1.2.4 實驗結果解釋

對本研究納入的282例研究對象查閱其HCV RNA檢測結果,并收集其血漿樣本進行RIBA試驗,若HCV RNA、RIBA檢測結果均為陰性,考慮HCV抗體結果為假陽性;若HCV RNA、RIBA檢測結果均為陽性,臨床診斷為真陽性(HCV現癥感染)[8];若HCV RNA結果為陰性,RIBA結果為陽性,包含兩種情況:①臨床診斷為真陽性(HCV既往感染);②對于無明確HCV感染史、無法證明其HCV感染的患者,則認為偶然因素導致RIBA結果為陽性,暫不納入研究;若HCV RNA結果為陰性,RIBA結果為不確定,則通過查閱患者病史、肝功能或既往抗體、HCV RNA檢測結果進行綜合判斷。

1.3 統計學方法

應用SPSS 23.0軟件進行數據分析。計數資料用百分率進行描述,組間率比較采用χ2檢驗。HCV抗體S/CO值與抗體真陽性率之間相關性進行Spearman相關系數計算,并應用Graphpad 8.0軟件進行ROC曲線分析,得到最佳ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)、靈敏度、特異度、約登指數及最佳S/CO值。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCV抗體初篩檢測患者臨床實驗室特征

在282例進行HCV抗體初篩的患者中,男性138例、女性144例,患者年齡21～84歲,221例患者(78.37%)HCV RNA結果為陰性,61例患者(21.63%)為HCV RNA陽性;78例患者(27.66%)RIBA結果為陰性,162例患者(57.45%)RIBA結果為陽性,42例患者(14.89%)RIBA結果為不確定,詳見表1。

表1 HCV抗體初篩檢測患者臨床實驗室特征

2.2 HCV抗體初篩檢測患者HCV感染狀態判斷

HCV抗體初篩結果為陰性的患者經HCV RNA及RIBA檢測后均為真陰性;在252例HCV抗體初篩陽性的患者中,HCV RNA、RIBA均陰性的患者48例,臨床考慮為HCV抗體假陽性;HCV RNA陽性、RIBA陽性的患者61例,臨床診斷為真陽性,為HCV現癥感染;HCV RNA陰性、RIBA陽性的患者共101例,通過查閱患者病史、肝功能結果、既往HCV抗體、HCV RNA檢測結果最終確定病毒已清除的HCV既往感染患者共95例,亦為HCV抗體真陽性;剩余6例患者無明確的HCV感染史,無法確定是否HCV感染,因此暫不納入研究;HCV RNA陰性、RIBA不確定的患者共42例,經過查閱病史及既往檢測結果,最終確定HCV既往感染患者32例,10例患者無法證明是否HCV感染,故暫不納入研究,詳見圖2。

圖2 HCV抗體初篩檢測患者感染狀態判斷

2.3 HCV抗體不同S/CO區間HCV RNA、RIBA結果分析

本研究將HCV抗體初篩為有反應性(S/CO ≥ 1)的樣本分成不同區間,分別統計不同S/CO區間的真陽性率,分析抗體S/CO與真陽性率之間的相關性。結果表明S/CO值越高,真陽性率越高。詳見圖3。進一步進行Spearman相關系數計算,r=0.608,P<0.000 1,呈正相關,結果提示HCV抗體S/CO值越高,真陽性率越高。詳見表2。

表2 HCV抗體不同S/CO區間HCV RNA、RIBA結果分析

圖3 HCV-Ab S/CO與真陽性率的相關性分析

2.4 ROC曲線分析確定HCV抗體最佳S/CO值

將HCV抗體檢測結果與HCV RNA與RIBA結果進行比較,通過ROC曲線分析確定HCV抗體陽性預測值 ≥ 95%的最佳S/CO值為7.83,此時靈敏度為93.09%,特異度為95.83%,AUC為0.98,詳見圖4。隨后本研究對HCV抗體S/CO ≥ 7.83的175例樣本進行分析,其中HCV RNA、RIBA結果同時陽性(HCV現癥感染)有56例,HCV RNA陰性、RIBA陽性有92例(均為HCV既往感染),HCV RNA、RIBA結果均陰性(假陽性)有2例,HCV RNA陰性、RIBA結果為不確定共25例,通過查閱病史或既往實驗室結果確定其均為HCV既往感染,上述提到本研究HCV RNA陽性即HCV現癥感染共61例,而有91.8%(56/61)的HCV現癥感染患者其抗體S/CO在7.83以上。此結果提示當HCV抗體S/CO ≥ 7.83且HCV RNA為陽性時意味著高風險活動性HCV感染,對于HCV RNA陰性、S/CO ≥ 7.83的患者極有可能為HCV既往感染,詳見表3。

表3 HCV抗體S/CO ≥ 7.83區間HCV RNA、RIBA結果分析

圖4 ROC曲線分析

3 討論

HCV感染是引起慢性肝病的主要原因,全球約有7 000萬人感染HCV,是全世界不容忽視的公共衛生問題[9],因此,對HCV感染進行及時而準確的診斷十分重要。HCV感染的診斷基于實驗室檢測,HCV抗體檢測因其操作簡便,靈敏度高成為HCV感染篩查的首選方法,然而HCV抗體陽性并不能明確區分HCV現癥感染、HCV既往感染以及抗體假陽性,HCV抗體陽性結果提示HCV活動性感染、病毒清除的HCV既往感染或HCV抗體假陽性[10-12]。研究[5]顯示,對于HCV低流行率的人群以及抗體弱陽性的人群,其抗體假陽性的概率更高。在實際工作中,常會遇到HCV抗體弱陽性的樣本,其抗體檢測結果往往是造成臨床診斷困惑的主要原因,同時也降低了檢驗報告的準確性。HCV抗體陽性的患者是否需要進一步處理一直是困擾臨床的難題[13],RIBA因其高特異性曾被廣泛作為HCV抗體的補充確證試驗[14],現階段對于HCV抗體陽性的患者進行HCV RNA檢測證實HCV 抗體結果,但HCV RNA陰性并不能排除HCV感染[15]。因此對HCV抗體陽性結果的準確解釋,區分HCV現癥感染、既往感染與假陽性是亟須解決的。近些年,有研究[3-4]證實HCV抗體S/CO值可預測病毒血癥,S/CO越高,抗體陽性率越高,對預測HCV感染具有重要價值。實驗室可確定抗體檢測臨界值來預測臨床診斷的真陽性[16]。不同實驗室由于所用儀器、試劑及方法學不同,因此尚無法統一抗體弱陽性臨界值,因此本研究擬確定本實驗室醫學決定水平,確定陽性預測值≥95%的最佳S/CO值,提高檢驗報告的準確性,協助臨床診斷,最大限度縮小非必要進行抗體補充確證試驗的人數。同時為探索不同系統丙型肝炎病毒抗體檢測試劑95%陽性置信區間建立方法學。

本研究收取了2021年7月至2022年2月于首都醫科大學附屬北京地壇醫院進行雅培化學發光免疫分析法檢測抗體同時進行HCV RNA檢測的患者血漿樣本共282例,進行RIBA確證試驗并查閱其HCV RNA結果,并統計HCV RNA及RIBA結果的分布情況,接下來根據實驗室檢測結果對HCV感染狀態進行區分,確定HCV抗體真陽性。根據丙型肝炎病毒實驗室檢測結果解讀指南[3],HCV RNA、RIBA結果均陽性樣本61例,臨床診斷為HCV現癥感染,為真陽性。HCV RNA及RIBA結果均陰性樣本48例,臨床考慮為抗體假陽性,當1

實驗室檢測對于HCV感染的診斷至關重要,其中HCV抗體檢測由于其靈敏度高、操作簡便等優勢成為HCV感染篩查的首個環節。但其方法學上存在假陽性,給臨床診斷造成一定的困惑。因此對于HCV抗體陽性的患者需進一步進行補充確證實驗來證實。近些年,有研究[3]證明HCV抗體S/CO值對于診斷HCV感染至關重要,疾病預防控制中心亦推薦不同實驗室應確定陽性預測值 ≥ 95%的S/CO臨界值,預測HCV感染,協助臨床診斷同時減少假陽性報告的出現,同時臨床可根據實驗室確定的S/CO臨界值做出正確決策,由此可見本研究具有很好的臨床價值。

由于不同的實驗室HCV抗體檢測的儀器試劑不同,尚無統一的S/CO臨界值,因此各實驗室均應建立本實驗室的醫學決定水平。本研究也希望為探索不同系統丙型肝炎病毒抗體檢測試劑95%陽性置信區間建立方法學。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明韓金育:進行實驗,數據分析,論文撰寫;郭晶晶:文章潤色;孟歡、陳瑾:臨床數據收集,協助數據分析;王雅杰:研究命題的提出,論文總體把關、審定。