經典名方二冬湯物質基準高效液相色譜指紋圖譜建立*

吳建明，華 杰，丁京偉，朱 婷，葉志學

（浙江維康藥業股份有限公司，浙江 麗水 323000）

二冬湯由天冬、麥冬、天花粉、黃芩、知母、甘草、人參、荷葉組方，具有潤肺、清胃功效，主治肺燥所致消渴，癥見煩渴不止、小便頻數、脈數無力等。臨床常用于治療糖尿病、百日咳、肺結核、慢性支氣管炎、陰虛咳嗽、甲狀腺功能亢進癥（簡稱甲亢）、糖尿病合并甲亢、糖尿病前期、尿崩癥、慢性胃炎、慢性咽炎、支氣管擴張等，療效確切［1-11］。現收錄于國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄（第一批）》，可按國家藥品監督管理局發布的《中藥注冊分類及申報資料要求》分類中的3.1 類古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑要求，通過簡化注冊程序研發古代經典名方二冬湯復方制劑。為保證復方制劑與傳統湯劑安全性和臨床療效的一致性，需制訂經典名方基準的質量標準，作為參照標準優化制劑的生產工藝和制劑質量標準。指標成分定性鑒別和定量分析難以反映物質基準的質量。標準參照物的質量是專屬性鑒別和多成分、整體質量控制的重復保證。指紋圖譜具有整體和特征定性鑒別作用，可全面、定性地評價中藥復方的質量，反映中藥復方藥效物質基礎，并從藥材、飲片、對應實物進行特征成分追蹤，反映其真偽。因此，本研究中建立了二冬湯物質基準的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為其質量標準的制訂提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀［連接G6530C 型四極桿- 飛行時間串聯質譜儀（Q - TOF -MS），配有獨立四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）和電噴霧離子源（ESI）］，1260Ⅱ型高效液相色譜儀，均購于Agilent 科技有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，Inertsil ODS - 4 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），均購于日本Shimadzu 公司；Tnature C18色譜柱［（250 mm×4.6 mm，5 μm），華譜科技有限公司］；BK-900B 型超聲儀（濟南巴克超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 集團，精度為十萬分之一）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司，精度為萬分之一）；LD610-2 型電子天平（沈陽龍騰電子科技有限公司，精度為百分之一）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為萬分之一）；DK-98-Ⅱ型萬用電爐（天津泰斯特儀器有限公司）；HWS - 26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

天冬飲片粉末（批號為TD-200313），麥冬飲片粉末（批號為MD-201127），黃芩飲片粉末（批號為HQ-200202），知母飲片粉末（批號為ZM-201205），天花粉飲片粉末（批號為THF-201228），荷葉飲片粉末（批號為HY-201112），人參飲片粉末（批號為RS-201127），甘草飲片粉末（批號為GC-201017），二冬湯物質基準（批號分別為D - 21082601，D - 21082602，D -21082603，D - 21082604，D - 21082605，D - 21082606，D - 21082607，D - 21082608，D - 21082609，D -21082610，D - 21082611，D - 21082612，D - 21082613，D-21082614，D-21082615，編號為S1-S15），均購于浙江維康藥業股份有限公司；黃芩苷對照品（批號為110715 - 201821，純度為95.4%），漢黃芩苷（批號為112002-201702，純度為98.5%），甘草酸對照品（批號為110731-201720，純度為97.7%），芒果苷對照品（批號為111607 - 201704，純度為98.1%），黃芩素對照品（批號為111595-201607，純度為98.5%），金絲桃苷對照品（批號為110521-201809，純度為94.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（成都普菲德生物技術有限公司，批號為170803，純度不低于98%）；乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak公司，批號為22100410G404）；乙酸銨（色譜純，批號為20210410），冰醋酸（色譜純，批號為20190110），均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇（分析純，廣州化學試劑廠，批號為2020070110）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Inertsil ODS - 4 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.05 mol/L 乙酸銨溶液-冰醋酸（取3.85 g乙酸銨溶于1 000 mL水中，加入30 mL冰醋酸），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按黃芩苷峰計應不低于2 500。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program（%）

2.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取二冬湯物質基準1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

單味藥材供試品溶液：取飲片粉末，天冬0.6 g，麥冬0.9 g，黃芩、知母、天花粉、荷葉各0.3 g，人參、甘草各0.2 g，精密稱定，分別加水50 mL，煎煮30 min，濾過，濾液蒸干，分別加70%乙醇溶解，轉移至50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2 項下供試品溶液、對照品溶液和空白溶劑（70%乙醇），按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果空白溶劑（70%乙醇）對測定無干擾，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液黃芩苷峰對應位置有相同色譜峰，且主要成分均有體現，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1. 黃芩苷A. 空白溶劑（70%乙醇） B. 對照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.BaicalinA.Blank solvent（70% ethanol） B.Reference solution C Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：取二冬湯基準（批號為D-21080501）1 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，以重復性試驗結果生成對照圖譜R，計算相似度。結果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對保留時間的RSD小于2.0%（n= 6），相似度均大于0.90，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取二冬湯物質基準（批號為D -21080501）1 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24，36，48 h 時按2.1項下色譜條件進樣測定，以重復性試驗結果生成對照圖譜R，計算相似度。結果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對保留時間的RSD小于2.0%（n=8），相似度均大于0.90，表明供試品溶液放置48 h內穩定性良好。

重復性試驗：取二冬湯物質基準為（批號為D -21080501）1 g，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以重復性試驗結果生成對照圖譜R，計算相似度。結果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對保留時間的RSD小于2.0%（n=6），相似度均大于0.90，表明方法重復性良好。

耐用性試驗：分別考察不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對色譜峰的影響，結果流速為1.2 mL/min 時9 號峰前移，綜合考慮效率，固定流速為1.0 mL/min。分別考察不同柱溫（25，30，35 ℃）對分離效果的影響，結果色譜圖中各共有峰的峰形尖銳、對稱，分離度良好，相似度為1.00，表明不同柱溫條件下該方法的耐用性良好。分別考察不同色譜柱對分離效果的影響，結果色譜柱為Inertsil ODS-4 時分離效果最佳，其余色譜柱分離效果不佳且信息量減少，故采用Inertsil ODS-4柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同S/N號進行測定，結果各共有峰峰形尖銳、對稱，分離度良好，相似度為1.00，表明不同色譜柱間該方法的耐用性良好。分別考察不同色譜儀，結果色譜圖中各共有峰的峰形尖銳、對稱，分離度良好，相似度為1.00，表明不同儀器間該方法的耐用性良好。

2.4 二冬湯指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜共有峰標定

取15 批（編號為S1-S15）二冬湯物質基準，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以15 批二冬湯物質基準HPLC 圖譜色譜峰進行自動匹配，形成共有模式圖，采用國家藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），選擇15 批樣品指紋圖譜中穩定性較好、響應值適宜的色譜峰為共有峰，共標定9個共有峰。詳見圖2。

圖2 二冬湯物質基準高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC overlay fingerprints of Erdong Decoction substance reference

2.4.2 對照圖譜建立

以15 批二冬湯物質基準HPLC 圖譜色譜峰進行自動匹配，生成共有模式圖；采用國家藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）建立對照圖譜，結果見圖3。經與對照品比對，確認芒果苷（峰1）、金絲桃苷（峰3）、黃芩苷（峰4）、千層紙素A - 7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（峰6）、漢黃芩苷（峰7）、甘草酸（峰8）、黃芩素（峰9）；經質譜指認，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸（峰2）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（峰5）。

2.4.3 指紋圖譜相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）對15批二冬湯物質基準與對照指紋圖譜的相似度進行評價，結果相似度最低為0.992，均大于0.90，故選擇指紋圖譜作為二冬湯物質基準的評價標準，詳見表2。暫訂本品與二冬湯物質基準對照指紋圖譜比較的相似度不得低于0.90。

表2 15批二冬湯物質基準指紋圖譜的相似度評價結果Tab.2 Similarity evaluation results of fingerprints of 15 batches of Erdong Decoction substance reference

2.4.4 藥味峰歸屬

取2.2 項下單味藥材供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，確定物質基準指紋圖譜中各峰的藥味歸屬（圖4）。峰1（芒果苷）為知母色譜峰，峰2（槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸）、峰3（金絲桃苷）為荷葉色譜峰，峰8（甘草酸）為甘草色譜峰，峰4（黃芩苷）、峰5（芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷）、峰6（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、峰7（漢黃芩苷）、峰9（黃芩素）為黃芩色譜峰。

1. 芒果苷 2. 槲皮素- 3 - O - 葡萄糖醛酸 3. 金絲桃苷4. 黃芩苷 5. 芹菜素- 7 - O - 葡萄糖醛酸苷 6. 千層紙素A - 7 - O - β - D - 葡萄糖醛酸苷 7. 漢黃芩苷 8. 甘草酸9. 黃芩素a. 二冬湯物質基準 b. 天冬 c. 麥冬 d. 黃芩 e. 知母f. 天花粉 g. 荷葉 h. 人參 i. 甘草圖4 藥味歸屬高效液相色譜對比圖1.Mangiferin 2.Quercetin - 3 - O - glucuronide 3.Hyperoside 4.Baicalin 5.Apigenin - 7 - O - glucuronide 6.Oroxylin A - 7 - O -β - D - glucuronide7.Wogonoside 8.Glycyrrhizic acid 9.Baicalein a.Erdong Decoction substance reference b.Asparagi Radix c.Ophiopogonis Radix d.Scutellariae Radix e.Anemarrhenae Rhizoma f.Trichosanthis Radix g.Nelumbinis Folium h.Ginseng Radix et Rhizoma i.Glycyrrhizae Radix et RhizomaFig.4 HPLC chromatogram of medicinal taste attribution

3 討論

3.1 流動相選擇

查閱二冬湯中天冬、麥冬［12-14］、天花粉［15］、黃芩［16］、知母［17］、甘草［18］、人參［19］、荷葉［20］的HPLC 指紋圖譜方法，初步選擇乙腈為流動相的有機相。曾以乙腈-0.2%磷酸為流動相，色譜峰多集中于16～42 min，前后信息量較少；后調整為乙腈-0.2%醋酸，通過優化，色譜峰集中于前60 min 內，但15～25 min 的色譜峰分離度不佳；通過優化，調整為乙腈-0.05 mol/L 乙酸銨-冰醋酸，分離效果優于前者，圖譜信息量較大，色譜峰較多，且各色譜峰分離度較好。最終確定流動相A 為乙腈，流動相B 為0.05 mol/L 乙酸銨溶液-冰醋酸，進行梯度洗脫。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

以色譜峰個數、整體分布呈現等為指標，考察供試品溶液提取溶劑（70%乙醇、稀乙醇、70%甲醇）超聲處理30 min 后所得色譜峰的差異。結果在同一洗脫條件下，色譜峰信息量、響應值均相差不大，且基線平穩程度基本一致。并結合黃芩苷含量測定方法，最終選擇70%乙醇為提取溶劑。

3.3 檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器，供試品溶液在190～400 nm波長范圍內掃描，通過等吸收圖譜進行分析，結果色譜峰在250～300 nm 波長范圍內的信息量較大。分別選取240，250，254，260，280，300，320 nm 波長處的色譜峰響應值進行分析，結果于254 nm 波長處較適中，色譜峰信息量較大，基線較平穩。故最終檢測波長選擇254 nm。

3.4 參照物選擇

黃芩苷色譜峰保留時間適中，響應值較高，達到基線分離，且黃芩苷較穩定，故選擇黃芩苷色譜峰作為對照品參照峰，標記為峰S，同時將黃芩苷對照品作為參照物。本研究中建立了二冬湯物質基準的HPLC 指紋圖譜檢測方法，通過15批樣品的測定，確定了對照指紋圖譜及9個共有峰，暫訂相似度不得低于0.90。

3.5 色譜峰指認

本研究中通過液質聯用儀進行二冬湯物質基準指紋圖譜中色譜峰指認，獲得超高效液相色譜-紫外光譜圖和超高效液相色譜-質譜總離子流圖。結合質譜初步指認出了其中9個成分，質譜分析結果與共有峰指認結果對應關系如下，峰1（芒果苷）為知母色譜峰，峰2（槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸）、峰3（金絲桃苷）為荷葉色譜峰，峰4（黃芩苷）、峰5（芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷）、峰6（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、峰7（漢黃芩苷）、峰9（黃芩素）為黃芩色譜峰，峰8（甘草酸）為甘草色譜峰，該結果為下一步深入研究奠定了基礎。

3.6 方法評價

該方法易操作、結果可靠，可用于二冬湯物質基準的質量控制。