土霉素原料及片劑中有關物質測定*

楊天風，張少萌，高燕霞，張 冬△

（1. 河北省藥品醫療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200； 2. 河北省藥品審評中心，河北 石家莊 050011）

土霉素又名氧四環素、地霉素等，屬第1 代生物發酵的四環素類抗菌藥物［1］。FINLAY 等于1950年自龜裂鏈霉菌的培養液中分離制得［2］。土霉素作用機制主要為阻止氨酰tRAN 與細菌核糖體結合，抑制細菌蛋白質合成，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用，對立克次體、螺旋體、某些原蟲等亦有抑制作用［3-4］。1950年，美國食品和藥物管理局（FDA）批準土霉素上市，我國于1952年開始生產，臨床常用劑型為片劑。土霉素原料收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準：抗生素藥品（第一冊）》WS1-C2- 0002- 89［5］（《簡稱部頒標準》）、《英國藥典》（BP2020）［6］、《歐洲藥典10.2》（EP10.2）［7］及《美國藥典42》（USP42）［8］；片劑收載于《部頒標準》及USP42。土霉素對光、熱敏感，遇光后顏色逐漸變暗，在pH 過低或過高和加熱條件下易失活。而我國現行質量標準中未對有關物質進行控制，產品存在一定安全隱患。為此，本研究中建立了測定土霉素原料及片劑中有關物質含量的高效液相色譜法［9-13］，在實現有效分離的基礎上，對雜質進行定性及限量控制；并根據國家計劃抽驗工作的部署和要求［14-15］，以該方法作為主要評價方法，對全國抽取的192批次土霉素片劑進行了綜合評價。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（配有紫外檢測器），UV-2450型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu公司；XS205型電子天平（瑞士Mettler公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

土霉素對照品（批號為130487 - 200703，含量為88.8%），四環素對照品（批號為130306-201419，含量為969 IU/ mg），美他環素對照品（批號為130499 -200101，含量為90.1%），脫水四環素對照品（批號為130402 - 200203），脫水差向四環素對照品（批號為130403 - 200204），4 - 差向四環素對照品（批號為130401 - 200209），均購自中國食品藥品檢定研究院；4 - 差向土霉素對照品（EPure，批號為E200712 -1020）；α-阿撲土霉素對照品（編號為A1220000），β-阿撲土霉素對照品（編號為A1230000），均購自EP Referrence Standard；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；醋酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；土霉素（原料，X，Y，Z 生產企業；制劑，18 家生產企業，編號為1-18，共192批次）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD SinoChrom C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為醋酸銨溶液［0.25 mol/L 醋酸銨-0.05 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液- 三乙胺（100∶10∶1，V/V/V），用醋酸調pH 至7.5］-乙腈（88∶12，V/V），B 為乙腈，梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

系統適用性溶液：取土霉素對照品（約含3%2-乙酰-2-去酰胺土霉素）適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液適量溶解，用水稀釋成每1 mL 含土霉素0.5 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品細粉適量（約相當于土霉素50 mg），精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

自身對照溶液：精密量取供試品溶液2 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，搖勻，即得。

土霉素對照品溶液：取土霉素對照品25.01 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻；精密量取2 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液定容，搖勻，即得。

混合雜質對照品溶液：取四環素、美他環素、脫水四環素、脫水差向四環素、4 - 差向四環素、4 - 差向土霉素、α-阿撲土霉素、β-阿撲土霉素及土霉素對照品各適量，精密稱定，加0.01 mol/ L 鹽酸溶液溶解并定容，制成每1 mL 分別含0.1 mg 的混合溶液，搖勻，濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備不含土霉素的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 系統適用性試驗

取2.2 項下系統適用性溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，土霉素峰的保留時間為12 min，土霉素峰與2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰（與土霉素峰相對保留時間約為1.1）的分離度為2.0。詳見圖1。

1. 土霉素 2.2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1.Oxytetracycline 2.2-Acetyl-2-deamidothetracyclineFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.4 方法學考察

強力破壞試驗：1）酸破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加2 mL 1 mol/L鹽酸溶液使溶解，60 ℃水浴20 min，取出，加2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液中和，用0.01 mol/L 鹽酸溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得酸破壞試驗溶液。2）堿破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶解，60 ℃水浴3 min，取出，加2 mL 1 mol/L 鹽酸溶液中和，用0.01 mol/L 鹽酸溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得堿破壞試驗溶液。3）高溫破壞。取土霉素對照品適量，120 ℃放置3 h，取10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得高溫破壞試驗溶液。4）氧化破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加30%H2O2溶液2 mL，室溫放置50 min，加0.01 mol / L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得氧化破壞試驗溶液。5）光照破壞。取土霉素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，4 000 lx光照48 h，搖勻，濾過，取續濾液，即得光照破壞試驗溶液。取上述5種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果樣品經酸、堿、高溫、氧化、光照破壞后，個別雜質增加明顯，提示樣品在酸、堿、高溫、氧化、光照條件下不穩定；主峰與雜質峰及雜質峰間的基線分離，且未知雜質不干擾主成分的測定。色譜圖見圖2。

1.4 - 差向土霉素 2.4 - 差向四環素 3. 土霉素 4. 美他環素 5. 四環素 6. 脫水差向四環素A. 酸破壞 B. 堿破壞 C. 高溫破壞 D. 氧化破壞 E. 光照破壞圖2 強力破壞試驗高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Oxytetracycline 4.Methicycline 5.Tetracycline 6.AnhydrotetracyclinA.Acid damage B.Alkali damage C.High - temperature damage D.Oxidative damage E.Light damageFig.2 HPLC chromatograms of the strong destructive test

專屬性試驗：精密量取2.2項下混合雜質對照品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果9 種成分均可實現基線分離，四環素與美他環素的分離度為1.5，其他各峰間的分離度均大于2.0，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖3。

1.4 - 差向土霉素 2.4 - 差向四環素 3. 土霉素 4. 脫水差向四環素 5. 四環素 6. 美他環素 7.α - 阿撲土霉素 8. 脫水四環素 9.β - 阿撲土霉素A. 混合雜質對照品溶液 B. 陰性對照品溶液圖3 專屬性試驗高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Oxytetracycline 4.Anhydrotetracyclin 5.Tetracycline 6.Methicycline 7.α- Apooxytetracycline 8.Anhydrotetracycline 9.β - Apooxytetracycline A.Mixed impurity reference solution B.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關系考察：取土霉素對照品11.26 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加0.01 mol/ L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液；分別精密吸取對照品貯備液0.5，1，2.5，5，10，20 mL，置100 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，以土霉素質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 1 991.6X-758.75（r=0.999 8，n=6）。結果表明，土霉素的質量濃度在0.5～20 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限確定：精密量取2.2項下土霉素對照品溶液適量，加0.01 mol/L 鹽酸溶液制成質量濃度為10 μg/mL的溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為10∶1 和3∶1 時的進樣量為定量限和檢測限。結果土霉素的定量限為5.0 ng，檢測限為1.4 ng。

精密度試驗：取2.2 項下土霉素對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.54%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫放置1，2，3，4，5，6，7，8 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結果隨著放置時間的延長，雜質含量略有增加，但各雜質含量變化的絕對值在0.1%范圍內，土霉素峰面積的RSD為0.85%（n= 8），表明供試品溶液在室溫放置8 h內較穩定，檢測有關物質時宜臨用現配。

耐用性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別采用不同色譜柱［CAPCELL PAK TYPE MGⅡ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），DiamonsilTMC18柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil GDLD SinoChrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液中雜質含量的RSD均在±0.1%范圍內，表明方法耐用性良好。

2.5 土霉素原料和制劑中雜質色譜圖確立

采用主成分自身對照法，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結果顯示，各企業樣品中檢出雜質含量相近，檢出雜質9 個，典型供試品溶液有關物質高效液色譜圖見圖4。采用已知雜質對照品定性雜質4 個，分別為4 - 差向土霉素、4 - 差向四環素、脫水差向四環素、四環素；經液相色譜串聯質譜（LC - MS/ MS）法初步分析結構，確定雜質1 與2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素結構一致，雜質2 為蛋白性雜質，雜質3 為土霉素氧化降解產物。

1.4 - 差向土霉素 2.2 - 差向四環素 3. 脫水差向四環素4. 四環素 5. 土霉素 6. 雜質1 7. 雜質2 8. 雜質3 9 - 10. 未知雜質圖4 供試品溶液有關物質高效液相色譜圖1.4 - Epioxytetracycline 2.4 - Epitetracycline hydrochloride 3.Anhydrotetracyclin 4.Tetracycline 5.Oxytetracycline 6.Impurity 1 7.Impurity 2 8.Impurity 3 9 - 10.Unknown impuritiesFig.4 HPLC chromatograms of relevant substances in the test solution

2.6 土霉素原料和制劑中有關物質含量測定

原料：取X，Y，Z 生產企業的土霉素原料樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。3家生產企業樣品中共檢出8種雜質，均為制劑雜質譜中的雜質，但未檢出脫水差向四環素，檢出量有差異。提示不同原料生產企業的生產工藝相近，脫水差向四環素在土霉素制劑生產過程中產生，其他均為原料引入。詳見表2。

表2 不同生產企業土霉素原料中有關物質含量測定結果（%）Tab.2 Results of the content determination of related substances in oxytetracycline API from different manufacturers（%）

制劑：取18 家生產企業的192 批次土霉素制劑樣品，每批樣品抽驗數量不少于5 批次，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。抽驗樣品中，合格率為100.00%，檢出雜質2-乙酰-2-去酰胺土霉素含量在1.62%～2.73%范圍內，其他雜質總含量在1.20%～1.84%范圍內。故以2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素作為標示指標控制產品質量。擬訂有關物質2-乙酰-2-去酰胺土霉素的限度為不得過對照溶液主峰面積的3.5%，其他各雜質峰面積之和不得過對照溶液主峰面積的2.0%。詳見表3。

表3 不同生產企業土霉素制劑中有關物質含量測定結果（%）Tab.3 Results of the content determination of related substances in oxytetracycline preparations from different manufacturers（%）

3 討論

3.1 色譜條件優化

EP10.2 土霉素有關物質檢測時，流動相需用到三氟乙酸及四氫呋喃，三氟乙酸酸性較強，具有一定揮發性，四氫呋喃長期使用會腐蝕peak 管。2020年版《中國藥典（二部）》［16］鹽酸土霉素項下有關物質檢測中，流動相的選擇更優，故以2020年版《中國藥典（二部）》鹽酸土霉素有關物質所示方法為基礎，對雜質對照品溶液進行預試驗，β-阿撲土霉素于104 min 出峰，為縮短分析時間，將等度洗脫優化為梯度洗脫，達到快速檢驗的目的。

BP2020 和EP10.2 土霉素有關物質項下檢測波長為254 nm，2020年版《中國藥典（二部）》鹽酸土霉素有關物質項下檢測波長為280 nm。對土霉素有可能產生的3種雜質（4-差向土霉素、α-阿撲土霉素、β-阿撲土霉素）進行二極管陣列檢測器（PDA）全波長掃描，三者的最大吸收均在254 nm波長處，故選擇檢測波長為254 nm。

土霉素在乙醇中微溶，在水中極微溶解，在氫氧化鈉和稀鹽酸中溶解，根據其溶解性，提取溶劑選擇0.01 mol/L鹽酸溶液。

3.2 線性范圍選擇

土霉素原料及片劑的主要雜質為2-乙酰-2-去酰胺土霉素，而目前中國食品藥品檢定研究院尚未提供2-乙酰-2-去酰胺土霉素的對照品，故采用主成分自身對照法對雜質的限量進行控制，此方法是2020年版《中國藥典》和其他國家藥品標準中應用最多、最廣泛的有關物質測定和計算方法。同面積歸一化法的思路一致，該方法也是在假定供試品溶液中所有雜質均與主成分分離且各雜質和主成分的響應因子均相同的前提下進行的，故方法驗證選擇土霉素定量限至2 - 乙酰- 2 - 去酰胺土霉素的最高限度3.5%的濃度作為線性范圍，以保證雜質的響應值位于線性范圍內。

主成分自身對照法的優點為操作簡單，運算方便，無需雜質對照品；缺點是忽略了各雜質與主成分的響應因子可能不同的事實，導致測得的雜質含量可能與真正的雜質含量存在差異。隨著雜質分離和制備技術的不斷發展，可采用雜質對照品外標法實現對特定雜質的精準控制。

3.3 特定雜質選擇

2-乙酰-2-去酰胺土霉素是土霉素發酵過程中產生的一種共生物雜質，其母環結構與土霉素相同，分子式極接近［17］，是影響土霉素質量的主要因素之一，故選擇2-乙酰-2-去酰胺土霉素作為特定雜質。通過對產品關鍵質量屬性的控制，進一步分析影響土霉素原料及制劑總體質量水平的主要產生因素，進而明確產品質量提高的方向。

3.4 方法評價

該方法操作簡便、專屬性好、靈敏度高，可用于土霉素原料及制劑中有關物質的測定。