鹽酸賴氨酸（注射用）細菌內毒素檢查法的研究

黃 逯，謝 鵬

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

賴氨酸是人體8種必需氨基酸之一，能改善人類膳食營養，促進人體的健康發育，增強免疫力，提高中樞神經功能［1-3］，臨床主要用于顱腦外傷、慢性腦組織缺血及缺氧性疾病的神經元保護［4-5］，可提高血腦屏障通透性，幫助藥物進入腦細胞。內毒素是革蘭陰性菌的細胞壁成分，細菌死亡或自溶后釋放出來，極微量內毒素進入人體即可產生發熱反應［6］，大量內毒素易導致休克、多器官衰竭甚至死亡［7-9］。發熱是鹽酸賴氨酸的不良反應［10］，以鹽酸賴氨酸（注射用）作為注射劑的原料藥時必須嚴格控制其生產質量及細菌內毒素含量。細菌內毒素按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143 細菌內毒素檢查法［11］檢測，通常采用鱟試劑試驗法［12］檢測，包括凝膠法及光度測定法。其中，凝膠法是檢測細菌內毒素最常用的方法，光度測定法包括濁度法和顯色基質法。細菌內毒素動態濁度法是以凝膠試驗為基礎發展起來的細菌內毒素定量檢測方法［13-14］，通過標準曲線對樣品中的內毒素含量進行定量檢測［15］，利用細菌內毒素在鱟試劑形成凝膠過程中的濁度變化定量測定細菌內毒素。本研究中參照2020年版《中國藥典（四部）》通則1143項下方法，采用凝膠法和動態濁度法進行鹽酸賴氨酸（注射用）細菌內毒素檢查?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan ET 型酶標儀（定量內毒素專用，美國Thermo Fisher公司）；ME204型電子天平（精度為萬分之一），Seven excellence 型多參數測定儀，均購于Mettler Toledo 公司；GR110DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（致微＜廈門＞儀器有限公司）；VORTEX 型周圍振蕩器（德國IKA公司）；DKB- 8A 型電熱恒溫槽（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸賴氨酸（注射用，廣西南寧邕江藥業有限公司，批號分別為22060701，22060801，22060901）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為2105281，效價為每支10 EU）；鱟試劑（KTA，靈敏度為10～0.005 EU/ mL，規格為每支1.25 mL，批號為2203090），鱟試劑（TAL-1，靈敏度為0.25 EU/mL，規格為每支0.1 mL，批號為2012101），細菌內毒素檢查用水（BET，批號為2105140，規格為每瓶50 mL），Tris緩沖液（批號為2104210，規格為每支4.0 mL），均購于湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（TAL-2，湛江博康海洋生物有限公司，批號為2011203，靈敏度為0.25 EU/mL，規格為每支0.1 mL）。

2 方法與結果

2.1 供試品細菌內毒素限值（L）確定

按規定，L=K/M，其中K為人最大可接受的內毒素劑量［EU/（kg·h）］，鹽酸賴氨酸（注射用）供生產注射劑使用，注射劑K為5 EU/（kg·h）；M為人用最大供試品劑量［mg/（kg·h）］，鹽酸賴氨酸（注射用）臨床1 次最大使用劑量為3.0 g，則成人的最大劑量M為50 mg/（kg·h）。故L為0.1 EU/ mg。根據注射劑安全性檢查的從嚴原則，確定鹽酸賴氨酸（注射用）限值為“每1 mg鹽酸賴氨酸中含內毒素的量應小于0.01 EU”，與2020年版《中國藥典》的要求一致，即擬訂L為0.01 EU/mg。

2.2 凝膠法

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核

用BET 溶解細菌內毒素工作標準品，并制成2λ，λ，0.5λ，0.25λ4 個濃度的溶液。按《中國藥典》規定，對鱟試劑的靈敏度進行復核，結果2批鱟試劑的測定靈敏度（λc）與標示靈敏度（λ）一致。詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab.1 Verification results of the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate

2.2.2 干擾預試驗

干擾試驗一：根據公式計算最小有效稀釋濃度（MVC），公式MVC =λ/L。其中，L為細菌內毒素限值0.01 EU/mg；λ為鱟試劑標示靈敏度。常用的鱟試劑靈敏度為0.03～0.5 EU/ mL，則供試品對應有效稀釋濃度為C0.5=0.5/0.01=50 mg/mL，C0.03=0.03/0.01=3 mg/mL。故選擇靈敏度為0.25 EU/mL 的鱟試劑進行干擾預試驗。取樣品（批號為22060701）0.25 g，加BET 5.0 mL溶解成質量濃度為50 mg/mL的溶液，用BET稀釋成質量濃度分別為25，12.5，6.25，3.125 mg/mL 的系列溶液，作為鱟試劑標識靈敏度陽性對照（NPC）；分別在上述系列溶液中加入細菌內毒素標準溶液，制成含2λ細菌內毒素的系列溶液，作為供試品陽性對照（PPC）；以BET 為陰性對照（NC）；以含2λ細菌內毒素的溶液為陽性對照（PC）。取鱟試劑TAL-1 和TAL-2，分別與NPC，PPC，PC 反應，各濃度平行2 管，觀察各管的凝膠反應。結果供試品質量濃度低于6.25 mg/mL 時對細菌內毒素標準品與鱟試劑反應無干擾，供試品的其他濃度均干擾較大，試驗無效。詳見表2?？紤]到用BET 溶解后供試品的pH 約為5.4，在最佳測試的（pH 6.0～8.0）。因此，選擇堿性的Tris緩沖液稀釋供試品，提高供試品pH值，進行干擾預試驗二。

干擾預試驗二：取樣品（批號為22060701）0.25 g，加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解，制成質量濃度為50 mg/mL的溶液（pH為7.12），其余操作同干擾預試驗一，觀察各管的凝膠反應。結果樣品質量濃度在3.125～50 mg/mL范圍內均無干擾。詳見表3。

表3 鹽酸賴氨酸（注射用）干擾預試驗二結果Tab.3 Results of the interference preparatory test Ⅱof Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.2.3 干擾試驗

選擇質量濃度為50 mg/ mL 的供試品，靈敏度為0.25 EU/mL 的鱟試劑進行試驗。用BET溶解并稀釋細菌內毒素工作標準品，得最終濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5 EU/mL 系列溶液。取3 批供試品（批號分別為22060701，22060801，22060901）0.25 g，分別加Tris緩沖液5.0 mL 溶解，制成質量濃度為50 mg/mL 的溶液（pH分別為7.10，7.18，7.13）。設溶劑系列和樣品系列，取不同濃度的細菌內毒素溶液各100 μL，分別加入100 μL鱟試劑水溶液或100 μL 鱟試劑樣品溶液，每個濃度平行4管。陰性對照（NC）和鱟試劑標示靈敏度對照（NPC）各設2 個平行管，反應結果按公式Es=antilg（∑Xs/4）和Et=antilg（∑Xt/4）計算。其中，Xs和Xt分別為溶劑系列、樣品系列各反應終點細菌內毒素濃度的對數值。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后1 個呈陽性結果的濃度。結果Es和Et均為0.25 EU/mL，表明質量濃度為50 mg/mL時，3批樣品均無干擾，可采用凝膠法進行檢查。詳見表4。

表4 鹽酸賴氨酸（注射用）質量濃度為50 mg/mL時的干擾試驗結果Tab.4 Results of the interference test of Lysine Hydrochloride（for Injection）with mass concentration of 50 mg / mL

2.2.4 樣品細菌內毒素檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143 細菌內毒素檢查法，使用2 個不同廠家、靈敏度為0.25 EU/ mL的鱟試劑，對質量濃度為50 mg/mL 的3 批樣品進行細菌內毒素檢查。結果3批樣品的細菌內毒素檢查均符合規定。詳見表5。

表5 鹽酸賴氨酸（注射用）細菌內毒素檢查結果Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3 動態濁度法

2.3.1 標準曲線建立和可靠性分析

用BET 溶解并稀釋細菌內毒素工作標準品，得濃度為0.12，0.06，0.03，0.015 EU/mL 的系列溶液，每次稀釋于漩渦混合器中混勻30 s，每個濃度平行3 管。用BET 作陰性對照，平行2 管。精密量取上述標準溶液及陰性對照溶液各100 μL，分別加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細菌內毒素測定儀測定。測定條件為溫度（37±0.5）℃，檢測波長405 nm，反應時間3 600 s。以細菌內毒素標準品濃度的對數（lgC）為橫坐標、反應時間的對數（lgt）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程lgt=2.869 6-0.289 5 lgC，r= -1.000 0（n=4），平行管間的變異系數（CV）為0.56%～1.89%，均小于2%，陰性對照管反應時間大于規定檢測時間，故細菌內毒素標準曲線成立。詳見表6。

表6 鹽酸賴氨酸（注射用）標準曲線可靠性分析結果Tab.6 Results of the reliability test of the standard curve of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗

按規定，最大有效稀釋倍數按MVD=CL/λ公式計算。式中，L為細菌內毒素限值0.01 EU/ mg，λ為標準曲線細菌內毒素最低濃度0.015 EU/ mL，得到試驗最大稀釋倍數為66.7倍。

取樣品（批號為22060701）0.50 g，加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解制成質量濃度為100 mg/mL 的溶液（pH 為6.98），用BET 將上述溶液稀釋成1，2，4，16，64 倍的系列溶液（A 液）。根據標準曲線，制備含細菌內毒素濃度為0.06 EU/mL 的上述濃度的供試品溶液（B 液）；細菌內毒素濃度為0.12，0.06，0.03，0.015 EU/ mL 的標準曲線溶液（C 液）；以BET 為陰性對照溶液（D 液）。取上述溶液100 μL，分別加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細菌內毒素測定儀測定。每個濃度平行2管，計算回收率?；厥章剩?）=（Cs-Ct）/λm×100%。其中，Ct為供試品溶液中內毒素含量，Cs為含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量，λm為0.06 EU/ mL。標準曲線回歸方程為lgt= 2.810 6 -0.306 4 lgC，r= 0.999 5（n= 5）。結果樣品在稀釋倍數為1，2，4，16，64倍條件下試驗的干擾性降低，回收率在50%～200%范圍內，均符合規定；且當供試品的稀釋倍數為1，2，4 倍時的回收率較好，且稀釋倍數較小，引入誤差小。故選擇100，50，25 mg/mL 質量濃度進行測定。詳見表7。

表7 鹽酸賴氨酸（注射用）干擾試驗結果Tab.7 Results of the interference test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

2.3.3 樣品中細菌內毒素含量測定結果

取3 批樣品（批號分別為22060701，22060801，22060901）各0.5 g，分別加Tris 緩沖液5.0 mL 溶解，成質量濃度為100 mg/mL 的溶液（pH 分別為7.01，7.06，7.03），用BET將上述溶液稀釋成1，2，4倍的系列溶液。按2.2.2項下方法制備標準曲線溶液和陰性對照溶液，選擇0.06 EU/ mL 作為λm，制備含細菌內毒素濃度為λm的上述供試品濃度的溶液。分別取100 μL，加入含100 μL 鱟試劑的光度法檢測用試管中，混勻，采用細菌內毒素測定儀測定，每個濃度平行2 管。標準曲線回歸方程為lgt=2.846 5-0.306 4 lgC，r=0.997 9（n=3）。結果回收率符合要求，準確穩定，表明供試品在選取的稀釋濃度下對試驗無干擾。詳見表8。

表8 鹽酸賴氨酸（注射用）細菌內毒素檢查結果Tab.8 Results of the bacterial endotoxin test of Lysine Hydrochloride（for Injection）

3 討論

鹽酸賴氨酸（注射用）水溶液呈微酸性，pH 值為5.4，已超過細菌內毒素檢查法的適宜范圍。預試驗中，采用細菌內毒素檢查用水稀釋樣品，凝膠法試驗干擾較強，動態濁度法試驗結果顯示回收率均不理想。通過過濾、中和、透析、加熱等方法對樣品進行處理，以避免干擾?？紤]pH 值的影響，本研究中采用Tris 緩沖液稀釋樣品，保證樣品pH 值為7.0，符合細菌內毒素檢查法的適宜范圍。結果凝膠法的干擾較小，且動態濁度法的試驗回收率均在50%～200%范圍內，可見上述處理方法能消除干擾因素對細菌內毒素檢查的影響。本研究中建立了檢測鹽酸賴氨酸（注射用）中細菌內毒素的凝膠法和動態濁度法，結果表明，凝膠法試驗中鹽酸賴氨酸（注射用）的L為0.01 EU/mg，質量濃度稀釋至50 mg/mL 時，對鱟試劑與細菌內毒素工作標準品的反應無明顯干擾；動態濁度法試驗中，質量濃度為100，50，25 mg/ mL 時，回收率為84.75%～96.12%，該系列濃度下對試驗無干擾。在凝膠法中，樣品稀釋較小倍數，可消除干擾，試驗有效；在動態濁度法中，較高質量濃度可排除干擾，測得定量數據。凝膠法和動態濁度法所選擇的稀釋倍數均低于現行標準中的稀釋倍數，操作方便快捷，具有檢測范圍寬、靈敏度高的優點。

綜上所述，所建立的檢測鹽酸賴氨酸（注射用）細菌內毒素的凝膠法和動態濁度法均可行，可用于其細菌內毒素的質量控制。