高效液相色譜法測定藏藥亞吉瑪（肉質(zhì)金腰）中金腰乙素含量*

郭麗萍，次旦多吉，任 剛，邱 毅，尼 珍△

（1. 西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院·國家藥品監(jiān)督管理局中藥＜藏藥＞質(zhì)量控制重點實驗室·西藏自治區(qū)藏藥標(biāo)準(zhǔn)化研究重點實驗室，西藏 拉薩 850000； 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)·中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004）

藏藥亞吉瑪漢譯名為金腰草，為金腰屬ChrysospleniumTourn.ex L. 植物。我國記載金腰屬植物有35種，分布于陜西、甘肅、云南、青海、四川、西藏等地區(qū)［1］。肉質(zhì)金腰Chrysosplenium carnosumHook.f.et Thoms. 分布于四川西部和西藏東部，生長于海拔4 400～4 700 m的高山灌叢草甸和石隙［2］。《晶珠本草》記載，亞吉瑪味苦，性涼，清膽熱，祛膽病，用于治療膽病引起的發(fā)燒頭痛、膽囊疾患、急性黃疸型肝炎、急性肝壞死等癥，為藏藥中常用上品［3］，是瀉膽熱病之主藥。課題組曾多次對藏區(qū)的金腰屬植物資源進(jìn)行調(diào)查，走訪藏藥材流通規(guī)模較大的藥材市場，對亞吉瑪藥材進(jìn)行市場調(diào)查，發(fā)現(xiàn)亞吉瑪?shù)闹髁髌贩N為肉質(zhì)金腰和長梗金腰。黃酮醇類衍生物為金腰屬植物的主要成分，黃酮醇屬酚類化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在自然界廣泛存在，能提高人體免疫力，具有抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用［4-9］，且對肝損傷有較好的改善作用［10-11］。前期研究對肉質(zhì)金腰中的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分離，獲得了含量較高的高度氧化的黃酮醇化合物，經(jīng)核磁共振波譜技術(shù)鑒定為金腰乙素［12］，可用作含量測定指標(biāo)。目前，未見肉質(zhì)金腰相關(guān)研究報道，且現(xiàn)行亞吉瑪?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和鑒別項，不能有效控制其質(zhì)量。故本研究中建立了測定肉質(zhì)金腰中金腰乙素含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

伍豐EX-1600 型高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司），配有自動進(jìn)樣器；BT124S 型電子天平（賽多利斯＜上海＞貿(mào)易有限公司，精度為十萬分之一）；SB - 5200DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；DE-100g型萬能粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

金腰乙素對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號為100173-202210，純度為98.08%）；乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；磷酸、丙酮、乙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；水為超純水；肉質(zhì)金腰藥材（編號為S1-S28，樣品信息見表1），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)慕澤涇副教授鑒定為正品。

表1 肉質(zhì)金腰藥材樣品信息Tab.1 Information of Chrysosplenium carnosum samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.2%磷酸溶液（40∶60，V/V）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取金腰乙素對照品適量，精密稱定，加丙酮溶解，搖勻，制得每1 mL 含1.0 mg 的對照品貯備液；取適量，依次稀釋2，4，8，16，32，64，128，256 倍，即得對照品溶液。取樣品粉末（過3 號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有色譜峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1。

1. 金腰乙素A. 對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.ChrysosplenetinA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 899.4X+5.323 4（R2=0.999 0，n=8）。結(jié)果表明，金腰乙素的進(jìn)樣量在0.04～5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2項下對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果金腰乙素峰面積的RSD為0.40%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.2項下供試品溶液10 μL，分別于配制后0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果金腰乙素峰面積的RSD為1.48%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批肉質(zhì)金腰藥材（編號為S1）粉末（過3 號篩）6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量。結(jié)果金腰乙素含量的RSD為1.53%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

耐用性試驗：取同一批肉質(zhì)金腰藥材（編號為S1）粉末（過3 號篩），按2.2 項下方法制備供試品溶液，以2.1項下色譜條件為基礎(chǔ)，分別改變進(jìn)樣量（10，15，20 μL），流速（0.8，1.0，1.2 mL/min），柱溫（25，30，35 ℃），色譜柱品牌（MYC，Shimadzu，Sepax），進(jìn)樣測定。結(jié)果金腰乙素含量的RSD分別為0.28%，3.07%，2.15%，0.83%（n=3），表明方法耐用性良好。

加樣回收試驗：取已知金腰乙素含量的同一批肉質(zhì)金腰藥材（編號為S7）粉末（過3號篩）6份，各0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入金腰乙素對照品貯備液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）1.4 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 金腰乙素加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of chrysosplenetin（n = 6）

2.4 樣品含量測定

分別取28 批（編號為S1-S28）肉質(zhì)金腰藥材粉末（過3 號篩）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定3 次，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算金腰乙素含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中金腰乙素含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of chrysosplenetin in samples（%，n = 3）

3 討論

3.1 基原考證

傳統(tǒng)藏醫(yī)藥中對植物的分類與現(xiàn)代植物學(xué)分類不同，造成藏醫(yī)藥用植物基原確定困難或多基原問題?！队钔妆静荨分杏涊d：“金腰子生長在石山雪線附近，葉面上有金色網(wǎng)紋，花為五寶裝飾很美麗。味苦，性涼，為瀉膽熱之藥?！保?3］金腰子分為5 種花色，花綠色者稱為后金腰子，花黃色者稱為金金腰子，花白色者稱為銀金腰子，花紅色者稱為銅金腰子，花藍(lán)色者稱為鐵金腰子［14］，這與《中國植物志（第八卷）》中對金腰屬植物的分類表述［2］不一致?！恫厮帢?biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，亞吉瑪?shù)幕瓰榛⒍菘浦参锫闱o金腰子Chrysosplenium nudicauleBunge.、山溪金腰子Chrysosplenium nudicauleD. Don.、腎葉金腰子Chrysosplenium nudicaule griffithiiHook. et Thoms. 的干燥全草［15］。現(xiàn)行藏藥標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊）》規(guī)定，亞吉瑪?shù)幕瓰榛⒍菘浦参锫闱o金腰Chrysosplenium nudicauleBunge. 及同屬數(shù)種植物的干燥全草［16］。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，裸莖金腰的野生資源較少，且生物量較小，藏醫(yī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)多使用肉質(zhì)金腰和長梗金腰。故本研究中選擇肉質(zhì)金腰為研究對象。

3.2 供試品提取方法選擇

分別考察不同提取溶劑（95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇及30%乙醇），結(jié)果50%乙醇的提取效率最高，且穩(wěn)定性好，故選擇50%乙醇為提取溶劑。分別考察不同提取方式（85 ℃水浴回流提取30 min，超聲提取30，45，60 min），結(jié)果超聲提取30 min的提取效率較高，影響因素較少，故選擇超聲提取30 min。

3.3 色譜條件選擇

分別考察不同流動相系統(tǒng)（乙腈- 0.2%甲酸、甲醇- 0.2%磷酸、乙腈- 0.2%磷酸）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對提取效果的影響，結(jié)果流動相為乙腈- 0.2%磷酸（40∶60，V/V），流速為1.2 mL/ min 時金腰乙素的色譜峰峰形最好，拖尾因子最小，故選擇2.1項下色譜條件。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確，精密度、重復(fù)性及耐用性均良好，可用于肉質(zhì)金腰中金腰乙素的含量測定。