醬香型白酒二輪次堆積酒醅酵母菌數(shù)量與理化指標變化分析

李潮云，盧 君*，馮海燕，李國輝，唐 平，梁樹英，劉 慧，楊志平，諶良杰，王 彬，焦 琳，張 帥

（1.貴州國臺酒業(yè)集團股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.貴州國臺酒業(yè)集團研究院，天津 300410）

醬香型白酒以高粱和小麥為主要原料，采用傳統(tǒng)醬香型白酒釀造工藝，因其突出的醬香和細膩口感而深受消費者的喜愛。高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)釀造的重要環(huán)節(jié)，在此過程中，酒醅網(wǎng)羅環(huán)境中的眾多微生物進行“二次發(fā)酵”，為入窖發(fā)酵提供了豐富的酶源和風味前體物質(zhì)，特別是酵母菌，其數(shù)量和種類在堆積發(fā)酵前后有大幅增加，為后續(xù)糖化和發(fā)酵過程提供動力[1-2]。由于成品大曲的發(fā)酵過程經(jīng)過兩次高溫階段，最高溫度能達到65 ℃左右，高溫使酵母菌數(shù)量變少導致其發(fā)酵力不足，然而堆積發(fā)酵能彌補這個缺陷[3-4]。另外，堆積發(fā)酵是在開放式環(huán)境中進行，其過程涉及到微生物群落與理化指標、風味物質(zhì)之間復雜的物理和化學關(guān)系，驅(qū)動著眾多微生物群落的演替，有利于釀酒微生物的富集，對白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量有重要影響[5-6]。

在深化工業(yè)數(shù)字化發(fā)展的今天，白酒行業(yè)需要在傳承傳統(tǒng)釀造工藝的基礎(chǔ)上，持續(xù)賦能傳統(tǒng)行業(yè)轉(zhuǎn)型升級，全面深化白酒現(xiàn)代化、數(shù)字化和標準化建設(shè)[7]。基于此，醬香型白酒產(chǎn)業(yè)提出了守正創(chuàng)新的理念和可持續(xù)發(fā)展的道路，逐步將人工上甑、潤糧、起堆、卸料等工序轉(zhuǎn)向由機械代替[8-9]。機械化生產(chǎn)降低了人員生產(chǎn)勞動強度、提高了生產(chǎn)效率，實現(xiàn)了集約用地和節(jié)能降耗，且同步提升了白酒工藝穩(wěn)定性[10]。曾立等[11]從原酒產(chǎn)質(zhì)量和白酒發(fā)酵過程對比傳統(tǒng)與半機械化生產(chǎn)之間的差異，發(fā)現(xiàn)在重要工序上進行機械化升級，其基酒質(zhì)量不會脫離傳統(tǒng)白酒酒質(zhì)特點。張建等[12]研究發(fā)現(xiàn)，機械化班組糟醅的理化指標如水分、酸度、淀粉和還原糖含量和出酒率、優(yōu)質(zhì)品率與傳統(tǒng)班組無顯著性差異（P＞0.05），也不會對基酒色譜成分產(chǎn)生不利影響。然而，目前對于研究智能化和傳統(tǒng)釀造模式下醬香型白酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量及理化指標變化規(guī)律和差異的報道較少。

本研究旨在對比智能化釀造和傳統(tǒng)釀造生產(chǎn)模式下，二輪次堆積發(fā)酵過程酒醅的溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分、酸度、L-乳酸和葡萄糖含量的變化規(guī)律，為白酒智能釀造生產(chǎn)技術(shù)的改進提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香型白酒酒醅：取自某酒廠不同車間（智能化車間和傳統(tǒng)車間）二輪次堆積發(fā)酵生產(chǎn)過程。從堆積發(fā)酵0 h、6 h、12 h、18 h……至堆積結(jié)束，采用5點取樣法，在堆積中部約深15 cm處圍著酒醅堆子轉(zhuǎn)一周取樣，將同一發(fā)酵時間的酒醅樣品混合（500 g）。

1.1.2 試劑

0.1%呂氏堿性美藍染色液（生化試劑）：上海恒遠生物科技有限公司；酚酞、氫氧化鈉、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-100生物傳感儀：深圳市西爾曼科技有限公司；CX43電子顯微鏡：美國奧林巴斯公司；TP-A2000電子分析天平：華志電子科技有限公司；YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊有限責任公司；TGL-16臺式高速低溫冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；OGS100烘箱：美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅溫度的測定

從起堆開始，直至入窖，每天將手持溫度計探頭插入堆子中部15 cm深度監(jiān)測，取3個測溫點記錄溫度數(shù)據(jù)。

1.3.2 二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌

數(shù)的測定

采用血球板計數(shù)法[13]測定酵母菌總數(shù)，采用美藍染色法[14]測定酵母活菌數(shù)。具體步驟為：稱取10 g酒醅樣品，加入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩15 min，取1 mL菌懸液低速離心，吸取上清液進行顯微鏡觀察，讀取酵母細胞數(shù)。將上清液高速離心，經(jīng)美藍染色后置于顯微鏡中讀取酵母活菌數(shù)。

1.3.3 酒醅理化指標的測定

水分：依據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[15]方法（第一法）檢測；酸度：依據(jù)DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》中和滴定法[16]中酸堿滴定法檢測；L-乳酸含量和葡萄糖含量：參照馮海燕等[17]的方法進行測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用Origin 2019對數(shù)據(jù)進行繪圖，實驗結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示，采用Spearman秩相關(guān)對非正態(tài)資料進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅理化及微生物指標的變化

2.1.1 溫度與酵母菌數(shù)量的變化

冬季氣溫普遍較低，微生物代謝所產(chǎn)生的熱量更容易與外界環(huán)境交換而散失，不利于堆子的升溫。為了縮短堆積發(fā)酵的時間，生產(chǎn)班組采取移堆工藝，遵循“面翻底，底翻面，中心翻四周”的原則，充分混勻后收攏堆子，以達到快速升溫的目的[18]，但這會導致酒醅酸度、水分等參數(shù)的變化，從而影響微生物群落的演替[19]。傳統(tǒng)及智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和溫度的變化見圖1。

圖1 傳統(tǒng)（A）及智能化（B）車間堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和溫度的變化Fig.1 Changes of total yeast counts,viable yeast counts and temperature of fermented grains during stacking fermentation process in traditional(A)and intelligent(B)workshops

由圖1可知，傳統(tǒng)車間從堆積開始至堆積結(jié)束入窖的堆積發(fā)酵時間為228 h，在138 h進行移堆，智能化車間堆積發(fā)酵時間為126 h，在96 h進行移堆。溫度是評價高溫堆積發(fā)酵進入窖池發(fā)酵的重要指標。由圖1A可知，傳統(tǒng)車間酒醅的溫度變化曲線呈“S”形，堆積前期和中期升溫緩慢，這與涂昌華等[20]研究堆積發(fā)酵溫度變化趨勢一致，堆積后期溫度隨堆積時間的增加而升高。由圖1B可知，智能化車間酒醅的溫度變化曲線呈“N”形，堆積前期升溫緩慢，堆積中期和后期升溫速率和降溫速率均比傳統(tǒng)車間快。

由圖1亦可知，兩種車間酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在106～107CFU/g波動變化。傳統(tǒng)車間堆積初期酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在107數(shù)量級；堆積中期升溫緩慢，酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)不斷增加，酵母菌生長旺盛，這為入窖發(fā)酵提供了酵母數(shù)量保障[21]；堆積后期溫度逐漸升高，酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)減少，入窖（228 h）時酵母菌數(shù)量維持在106數(shù)量級，這可能是由于溫度升高后氧氣減少和發(fā)酵不均衡等因素使酵母菌生長受限。智能化車間堆積初期酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在106數(shù)量級；堆積中期酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)隨著堆積溫度的上升而增加，其數(shù)量基本維持在107數(shù)量級；堆積后期在84 h時酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)隨著溫度的上升而迅速增長，隨后溫度超過35 ℃時又迅速下降至106數(shù)量級，此時不耐高溫的酵母菌開始衰亡，96 h移堆后酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)隨溫度的升高而增加，入窖（126 h）時酵母菌數(shù)量在107數(shù)量級。

2.1.2 酸度和L-乳酸含量的變化

酸度不僅能影響白酒的風味，還能調(diào)控微生物的生長代謝。適宜的酸度有助于入窖發(fā)酵的酒醅糖化和發(fā)酵，也能夠抑制雜菌的生長[22]。在堆積發(fā)酵后期，酒醅中乳酸桿菌占主導地位，乳酸只由乳酸菌產(chǎn)生[17]，因此測定L-乳酸含量一定程度上能體現(xiàn)乳酸菌的生長狀態(tài)[23]。兩個車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度和L-乳酸含量變化見圖2。

圖2 傳統(tǒng)和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度和L-乳酸含量的變化Fig.2 Changes of acidity and L-lactic acid contents in fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional and intelligent workshops

由圖2可知，傳統(tǒng)車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度呈現(xiàn)動態(tài)變化的趨勢。堆積前期酵母菌、細菌和霉菌等生酸微生物生長代謝產(chǎn)生有機酸[24]，酸度有所增加，然而隨著堆積溫度上升抑制了生酸微生物的代謝，酸度有所降低。移堆后有機酸在酯類等風味物質(zhì)的合成過程以及生酸微生物的代謝過程中被消耗[19]，酸度從移堆時的2.17 mL/g下降至入窖（228h）時的1.51mL/g。智能化車間堆積前期酒醅的酸度變化較為平穩(wěn)，在54 h時酸度明顯下降至0.63 mL/g。堆積后期酒醅溶氧量增加，霉菌等微生物生長繁殖產(chǎn)生的酸性蛋白酶開始分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種氨基酸類物質(zhì)使酸度增加[25]，發(fā)酵至114 h時酸度開始下降，在入窖（126 h）時酸度為0.87 mL/g。

傳統(tǒng)車間酒醅的L-乳酸含量與酸度變化趨勢基本一致。堆積前期隨著水汽揮發(fā)，酒醅中乳酸等揮發(fā)性有機酸含量不斷下降，同時乳酸菌生長代謝產(chǎn)生乳酸，導致L-乳酸含量呈現(xiàn)出波動性變化趨勢。堆積后期L-乳酸含量呈下降趨勢，至入窖（228 h）時L-乳酸含量下降至3.73 mg/g，比堆積初期下降了0.87 mg/g。智能化車間酒醅的L-乳酸含量整體呈現(xiàn)動態(tài)變化的趨勢，堆積前期L-乳酸含量變化較為平穩(wěn)，堆積84 h時其含量下降至3.50 mg/g，堆積96 h時L-乳酸含量又增加至4.86 mg/g，造成其含量明顯波動的原因可能是72～84 h堆子升溫過快，揮發(fā)性有機酸受熱分解，L-乳酸含量下降，隨后84～90 h溫度又迅速下降使其含量開始增加。移堆后L-乳酸含量持續(xù)下降，在入窖（126 h）時L-乳酸含量為3.60 mg/g。

2.1.3 水分和葡萄糖含量的變化

傳統(tǒng)車間和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅水分和葡萄糖含量的變化見圖3。水分維持在合理范圍內(nèi)有利于堆積發(fā)酵和窖內(nèi)發(fā)酵。由圖3可知，傳統(tǒng)車間酒醅的水分含量在36%～43%波動。堆積前期堆子松散，隨著水汽蒸發(fā)，水分自然流失。隨著堆積時間的增加，微生物的生長繁殖代謝過程以及淀粉的降解過程產(chǎn)生水分，水分含量呈上升趨勢，同時微生物繁殖代謝產(chǎn)生的熱量也會使水分降低[26-27]。移堆后酒醅充分接觸氧氣，促進了微生物的生長繁殖和酒醅中淀粉的降解，水分含量不斷增加。智能化車間酒醅中水分含量在37%～43%波動，其含量在整個堆積階段變化幅度較小。堆積前期也因水汽蒸發(fā)導致水分含量降低，水分含量隨著微生物的發(fā)酵過程、淀粉的降解過程的變化而變化。與傳統(tǒng)車間不同的是，移堆工藝并未對智能化車間堆積過程酒醅水分含量產(chǎn)生明顯影響。總之，兩種車間水分含量變化主要與溫度和微生物發(fā)酵情況有關(guān)。

圖3 傳統(tǒng)和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅水分（a，b）和葡萄糖含量（c，d）的變化Fig.3 Changes of moisture (a,b) and glucose contents (c,d) in fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional and intelligent workshops

葡萄糖作為一種能源物質(zhì)可以直接被酒醅中微生物所利用[28]，同時酒醅中淀粉被微生物分解產(chǎn)生葡萄糖。傳統(tǒng)車間堆積過程中葡萄糖含量整體呈先上升后降低的趨勢。堆積前期呈上升趨勢，葡萄糖含量從堆積0 h 的5.75 mg/g上升至堆積138 h的19.23 mg/g，移堆后增大了與酒醅的空氣接觸面積，微生物生長旺盛從而消耗大量葡萄糖，其含量呈下降趨勢，入窖（228 h）時葡萄糖含量下降至9.26 mg/g。智能化車間葡萄糖含量在堆積前期隨著堆積時間增加而增加，從堆積0 h的10.22 mg/g增加至72 h的18.05 mg/g，但在堆積后期受堆積升溫速率、移堆工藝共同影響下呈“兩次降低，兩次升高”的趨勢，至堆積終點（126 h）時葡萄糖含量為11.13 mg/g。

2.2 不同車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物及理化指標之間相關(guān)性分析

有研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅理化因子與微生物群落之間關(guān)系密切[29]。因此，采用Spearman相關(guān)性分析堆積時間、溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分、酸度、葡萄糖和L-乳酸之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 傳統(tǒng)（A）及智能化（B）車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物及理化指標之間的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.4 Correlation analysis results between microorganism and physicochemical indexes of fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional (A) and intelligent (B) workshops

由圖4A可知，傳統(tǒng)車間堆積時間與溫度、水分之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；溫度與水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；酵母菌總數(shù)與酵母活菌數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；葡萄糖與酸度、L-乳酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；然而酸度與L-乳酸呈正相關(guān)性但不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，智能化車間堆積時間與溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與L-乳酸呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；溫度與酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與L-乳酸呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；酵母菌總數(shù)與酵母活菌數(shù)之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且兩者均與L-乳酸呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；水分與葡萄糖、L-乳酸呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；酸度與其他7個指標均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；葡萄糖與L-乳酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

綜上所述，傳統(tǒng)和智能化車間在二輪次堆積發(fā)酵時隨著堆積時間的增加，溫度和水分含量也隨之增加，說明堆積過程的溫度和水分含量，是判斷堆積發(fā)酵是否結(jié)束的重要參考指標，這與生產(chǎn)經(jīng)驗一致。兩種車間葡萄糖含量和L-乳酸含量間、酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明在堆積發(fā)酵過程中能影響微生物群落演替的指標也是綜合判斷堆積發(fā)酵是否結(jié)束的參考指標。因此，在堆積期間需要結(jié)合前期輪次實際情況控制好起堆溫度，保障前期逐步糊化和酒醅疏松溶氧，同時密切關(guān)注酒醅水分、發(fā)酵溫度和微生物群落的演替情況。

3 結(jié)論

本研究對比分析智能化與傳統(tǒng)釀造車間在二輪次堆積過程中酒醅理化指標與酵母菌數(shù)量的變化差異，發(fā)現(xiàn)兩種車間酒醅的溫度隨堆積時間增加而逐漸升高，移堆后溫度呈先下降后升高的趨勢，傳統(tǒng)車間酒醅溫度變化呈“S”形曲線，而智能化車間則呈“N”形曲線；堆積期間，兩種車間酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)受溫度影響，在106～107CFU/g范圍內(nèi)呈現(xiàn)波動性變化，當溫度達到35 ℃時，傳統(tǒng)車間酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)呈下降趨勢，而智能化車間則呈上升趨勢；兩種車間酒醅的水分隨堆積時間的增加整體呈波動性上升趨勢，酸度、L-乳酸和葡萄糖含量整體呈現(xiàn)先增加后降低的波動性變化。值得關(guān)注的是，移堆工藝會對二輪次堆積過程中的酒醅理化因子和酵母菌群落變化產(chǎn)生影響。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，溫度和水分均與堆積時間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這兩項指標可作為判斷發(fā)酵進程的重要依據(jù)。此外，葡萄糖含量和L-乳酸含量間、酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。二輪次堆積發(fā)酵的好壞直接關(guān)系到三輪次的基酒質(zhì)量，因此需要按照實際生產(chǎn)要求，合理控制好起堆溫度，保障前期逐步糊化與酒醅的疏松溶氧，密切關(guān)注理化指標和微生物群落的演替情況。然而，堆積發(fā)酵是一個極其復雜的過程，后續(xù)將深入研究在智能化釀造與傳統(tǒng)釀造模式下，全年堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵過程中理化指標和關(guān)鍵釀酒微生物的影響，進一步解析白酒智能釀造生產(chǎn)中關(guān)鍵指標和微生物的變化規(guī)律。