酵母強化大曲接種量優化及其生產應用

張 軍，孫 騰，張翠云，董培方，朱立寧，馬輝峰*

（河北鳳來儀酒業有限公司，河北 邢臺 055550）

曲為酒之骨，說明大曲在白酒釀造過程中的重要性[1]。大曲是富集培養有益微生物及其代謝產物的載體[2]，在釀酒發酵過程中起著重要的糖化、發酵等作用[3]，可以有效地將原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質轉化為酒精及特征風味物質，并能在發酵過程中為白酒提供大量的呈香呈味物質或香味前體物質[4-5]。大曲發酵的產量和質量與釀造過程中的微生物密切相關[6]，有好酒必有好曲，大曲的品質是白酒質量的重要影響因素[7]。

大曲是釀酒的源頭，為了滿足與日俱增的市場需求，提高大曲的生產質量和產量便成為泥坑酒業的迫切任務。酵母菌作為產酒的主體[8]，是產酒的主要途徑[9]。傳統釀酒行業使用的大曲，含有豐富多樣的物系、菌系和酶系[10]，其分離出的菌株主要有霉菌、酵母菌、細菌和放線菌[11]，為傳統固態釀酒發酵提供了香味成分[12]、能量營養物[13]以及催化動力[14-15]。中高溫大曲的頂溫60 ℃，此時絕大部分酵母菌死亡[16]，影響了白酒主體呈香及呈味物質的合成與積累，不利于保持成曲質量的穩定性。泥坑酒業所處地域夏季氣溫炎熱潮濕，晝夜溫差小，最高氣溫在35 ℃以上，致使曲坯入房初始溫度達到30 ℃以上，難以滿足酵母菌等微生物附著、繁殖最佳條件[17]。成曲在夏季貯存后，會出現糖化力較高和發酵力較低現象。

本研究為提高泥坑濃香型白酒中高溫大曲綜合生產性能，篩選綜合性能較高的酵母菌株，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色初篩，以糖液發酵液酒精度、發酵力、總酸、總酯、還原糖為檢測指標復篩，并考察篩選菌株菌株之間的配比對成曲發酵特性的影響，探索復配酵母菌株強化高溫大曲的生產應用價值，以進一步完善濃香型白酒釀造微生物功能菌菌種資源庫，為培曲強化菌種的合理搭配、使用及大曲科學化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料中高溫大曲樣品：河北鳳來儀酒業有限公司制曲車間；高粱：遼寧阜新；大麥、小麥：來自本地。

1.1.2 試劑

淀粉酶（酶活2 000 U/g）、糖化酶（酶活50 000 U/g）：邢臺新華酶制劑廠；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（分析純）：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：青島海博生物技術有限公司。

富集培養基（4°Bé麥芽汁培養基）：大麥洗凈浸泡12 h，陰涼處發芽后曬干研磨成粉，取粉碎樣若干，加入4倍麥芽質量的水，攪拌均勻，在55～60 ℃水浴內保溫糖化4 h，取出過濾，濾液調整到4°Bé麥芽汁。0.1 MPa滅菌20 min。

分離培養基：YPD固體培養基1 000 mL，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g。121 ℃滅菌20 min。

初篩培養基：TTC下層培養基為YPD固體培養基，121 ℃滅菌20 min；TTC上層培養基，TTC 0.5 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.0，115 ℃滅菌20 min。培養基滅菌后，冷卻至60 ℃時，加入TTC溶液10 mL完全覆蓋下層菌落，立即傾于底層平板上。

發酵培養基：取一定質量高粱粉，加入5倍質量蒸餾水蒸煮1～2 h，按20 U/g高梁粉質量加入淀粉酶液化，液化完全后補加與高粱粉同等質量的60 ℃水[18]，加入0.5%的糖化酶，攪拌均勻，在60 ℃糖化3～4 h，用稀碘液試之不顯藍色，再加熱至90 ℃，用細白布過濾，測量溶液的糖度并調整為6°Bé。121 ℃滅菌20 min[19]。

6°Bé糖液培養基：100 mL6°Bé糖液，115 ℃滅菌20 min。小麥粉培養基：取曲塊壓制前加水后的小麥粉加入10倍質量28 ℃溫水。

1.2 儀器與設備

DNP-9052電熱恒溫培養箱：上海精其儀器有限公司；HH-6恒溫數顯水浴鍋：金壇新瑞儀器廠；THZ-103B搖床：上海一恒科學儀器有限公司；BSM520.3電子分析天平：上海卓精電子天平有限公司；SW-CJ-2G凈化工作臺：上海精密儀器儀表有限公司；XSP-BM-10C顯微鏡：上光儀器有限公司；75A高壓滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株富集

曲坯入曲室培養30～40 h時，選取大曲表面白色和淡黃色“突起”和片狀“白斑”（酵母菌），用接種環勾取3～4環，放入富集培養基中，30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養20 h，靜置，挑去菌膜附著物，去掉上清液，取沉淀酵母二環，連續富集2～3次。

1.3.2 菌株分離和純化

將富集后的菌株按10倍梯度稀釋，吸取稀釋梯度為10-4、10-5、10-6的菌液0.1 mL均勻涂布于分離培養基，30 ℃恒溫靜置培養24 h，挑取生長良好，菌落、細胞形態不同且均符合酵母菌特性菌株，于分離培養基平板劃線純化，30 ℃恒溫培養24 h。

1.3.3 TTC平板顯色初篩

將分離純化得到的酵母菌點接到TTC下層培養基上，35 ℃培養8～16 h，待長出菌落后，倒入10 mL TTC上層培養基，覆蓋菌落，于30 ℃避光保溫，培養16 h。TTC能使酵母菌的代謝產物產生呈色變化，鑒別酵母中呼吸酶活力的高低，即酵母產酒精效率的優劣[20]，顏色越深，效率越高[21]。因此初篩出顏色深紅，生長良好的菌株。

1.3.4 發酵實驗復篩

將初篩菌種接種至YPD液體培養基中活化，30 ℃、150 r/min振蕩培養20 h后，接種到發酵培養基中，每瓶接種2 mL，發酵栓密封，30 ℃恒溫培養10 d，測定其酒精度、發酵力、總酯、總酸及還原糖含量。

1.3.5 篩選菌株復配

將通過初篩、復篩得到的Y1、Y2、Y33株菌株，單獨接種至6°Bé糖液培養基中，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養24 h后，得到種子液。分別制備Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3混合種子液（體積比1∶1）、Y1-Y2-Y3混合種子液（體積比1∶1∶1），再將混合后的種子液以2%接種量接種至6°Bé糖液培養基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養20 h，酵母菌計數。得到混合培養后的Y1-Y2、Y1-Y3、Y2-Y3、Y1-Y2-Y3菌懸液，接種至發酵培養基中進行發酵實驗。

1.3.6 篩選菌株接種量優化響應面試驗

根據生產實踐經驗，以菌株發酵液的主成分綜合得分（Z綜合得分）（Y）為響應值，菌株Y1接種量（A）、菌株Y2接種量（B）和菌株Y3接種量（C）為自變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗，響應面試驗因素及水平見表1。

表1 菌株接種量優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for strain inoculum optimization

1.3.7 酵母強化大曲生產應用

曲塊入房時，將篩選酵母按最佳比例制成混合培養液，用毛刷沾培養液均勻涂抹于曲坯表面，然后將曲坯放入培養室內培養，同時以沒有涂混合培養液的大曲作對照，培曲30 d后取樣，檢測大曲質量指標（水分、酸度、發酵力、糖化力、液化力、皮張），培曲條件同常規管理。

1.3.8 分析檢測

發酵力、水分含量、酸度、糖化力、液化力的測定：參考QB/T 4257—2011《大曲通用分析方法》；皮張的測定：參照《白酒生產技術全書》[10]；酒精度的測定：采用酒精計；總酸的測定：采用氫氧化鈉滴定法；還原糖的測定：采用斐林試劑滴定法；總酯的測定：參考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中的皂化法；酵母菌數：采用血球計數板計數。

1.3.9 主成分分析及綜合得分

主成分分析（principal component analysis，PCA）用于多指標綜合評價，在分析過程中經過數學變換生成相對于人為確定較少的權數，減少了工作量，有助于更客觀地描述處理的效果[22]。根據林海明等[23]的方法計算2個主成分與原來5個品質指標的標準化數據的線性組合，即各主成分的表達式，其線性組合為：

第一主成分：Z1=0.284×發酵力-0.412×酸度+0.18×總酯+0.311×酒精度-0.092×還原糖，

第二主成分：Z2=-0.096×發酵力-0.305×酸度+0.565×總酯-0.029×酒精度+0.367×還原糖。

應用這一線性組合計算出各主成分值和方差貢獻率（Z1為67.997、Z2為30.701），最后利用各個主成分的方差貢獻率得到綜合主成分函數：Z綜合得分=67.997×Z1+30.701×Z2。

1.3.10 數據處理

使用Excel 2016整理，采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計，并運用SPSS 16.0統計軟件對實驗結果進行PCA，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離篩選

2.1.1 酵母菌的分離、初篩

共分離純化8株菌落形態不同的菌株，菌落均為乳（潔）白色，圓潤，易挑起，結合細胞形態初步鑒定8株菌株為酵母菌屬。通過菌落形態觀察和菌落是否帶有酒酯香味為依據，選取菌落大而凸起、酒酯香味濃郁的4株菌作進一步篩選。在相同培養條件下，菌落的大小和TTC顏色的深淺可反映酵母菌的增殖能力和活力，即產酒能力越強，顏色越明顯[24-25]。其中，共得到菌落顏色呈深紅色的3株菌，編號分別為Y1、Y2、Y3，其菌落、細胞形態見圖1。

圖1 菌株Y1、Y2、Y3的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strains Y1, Y2 and Y3

2.1.2 酵母菌的復篩

酵母菌能在無氧條件下將糖類機質轉化為酒精[26]，并產生二氧化碳[27-28]。因此可根據發酵液中的酒精度、總酸、總酯、還原糖以及發酵力來判斷酵母菌的生命活力及產酒產酯能力[29]。菌株Y1、Y2、Y3的發酵能力檢測結果見表2。

表2 篩選菌株發酵能力檢測結果Table 2 Fermentation ability results of the screened strains

由表2可知，菌株Y1發酵液的酒精度為2.31%vol，總酯為16.24 g/L，說明菌株Y1有較強的產酒能力及產酯能力，菌株Y2發酵液的酒精度為1.42%vol，總酯為21.81 g/L，說明菌株Y2產酯能力在3株菌株中最強，但產酒能力較弱，菌株Y3發酵液的酒精度為3.51%vol，總酯為6.66 g/L，說明菌株Y3產酒能力在3株菌株中最強，但產酯能力最弱。此外，菌株Y1的總酸含量最高（7.75 g/L），菌株Y2的還原糖含量最高（3.41 g/100 mL），菌株Y3的發酵力最高，為4.46 g/（g·72 h）。

2.2 復配菌株發酵性能分析

混合培養結果表明3株菌間有較好的共生能力，但在發酵性能上是否存在協同促進作用需要一步研究證明，因此本試驗先對3株菌之間進行復配發酵試驗，復配菌株發酵能力檢測結果見表3。

表3 復配菌株發酵能力檢測結果Table 3 Fermentation ability results of the mixed strains

由表3可知，復配菌株綜合得分由高到低的順序為：菌株Y1-Y2-Y3、Y2-Y3、Y1-Y3、Y1-Y2，分別為423.68、414.80、368.93、260.64。Y1-Y2-Y3組合的綜合得分最高，為最優試驗組，表明從大曲中篩選出的這3株菌能夠較好地進行菌株協同發酵。

2.3 菌株接種量優化響應面試驗

2.3.1 響應面試驗結果

響應面試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。采用Design Expert 8.0.6軟件對表4中的數據進行多項二次擬合，并獲得Z綜合得分對菌株Y1接種量（A）、菌株Y2接種量（B）和菌株Y3接種量（C）的二次多項回歸方程為：

表4 接種量優化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface experiments for strain inoculum optimization

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

由表5可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P值=0.994 9＞0.05），說明該回歸模型可靠。另外，模型的決定系數R2=0.987 1，調整決定系數R2Adj=0.970 5，說明擬合程度良好，表明該回歸模型可用于綜合得分值的預測。由P值可知，一次項A、B、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2對綜合評分值影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）；由F值可知，影響Z綜合得分的因素順序為：菌株Y2接種量（B）＞菌株Y1接種量（A）＞菌株Y3接種量（C）。

2.3.2 各因素間交互作用的響應面分析

響應面越陡峭、等高線圖越接近橢圓，說明兩因素間交互作用對響應值的影響越大[30]。各因素間交互作用對Z綜合得分影響的響應曲面及等高線見圖2。

圖2 菌株Y1、Y3接種量間交互作用影響綜合得分值的響應面及等高線Fig.2 Response surface and contour lines of the effect of the interaction between strain Y1 and Y3 inoculum on the overall score value

由圖2可知，交互項AC的響應面較陡峭，等高線形狀最接近橢圓，對Z綜合得分的影響極顯著（P＜0.01），這與方差分析結果一致。

由Design-Expert 8.0.6軟件預測出菌株Y1、Y2和Y3的接種量分別為6.9×108個/mL、2.7×108個/mL、1.5×108個/mL，在此優化條件下，Z綜合得分理論值為513.107，為方便實際生產操作，將菌株接種量條件修正為：7.0×108個/mL、3.0×108個/mL、1.5×108個/mL，在此條件下進行3次平行驗證試驗，Z綜合得分實際值為513.096，與預測值相差不大，驗證了該模型具有較好的準確性。

2.4 酵母強化大曲的生產應用

對照曲與試驗曲理化指標的檢測結果見表6。

表6 對照曲與試驗曲理化指標分析結果Table 6 Analysis results of physicochemical indexes in control and experimental Daqu

由表6可知，經過酵母強化后，所生產的大曲發酵力、糖化力和液化力分別為3.46 g/（g·72 h）、994 mg/（g·h）、1.12 g/（g·h），與對照曲相比，分別提高了424%、6.7%和5.7%，尤其發酵力明顯提升。所生產的大曲水分含量為13.36%，比對照曲降低0.22%，說明發酵能排出更多的水分，發酵比對照曲更良好；皮張為0.22 cm，比對照曲減少0.44 cm，說明殘余淀粉減少，淀粉利用率提升，發酵更徹底；酸度為1.17 mmol/10 g，比對照曲增加0.09 mmol/10 g，說明復配酵母菌株活力增強，曲質更優良。

3 結論

本研究從中高溫大曲中共分離純化出8株菌株，其中，3株產酒性能良好的菌株Y1、Y2、Y3，其最佳接種量分別為7.0×108個/mL、3.0×108個/mL、1.5×108個/mL，在此優化復配條件下，主成分Z綜合得分為513.096，采用該菌株生產的強化大曲發酵力、糖化力和液化力分別為3.46 g/（g·72 h）、994 mg/（g·h）、1.12 g/（g·h），比優化前提高了424%、6.7%和5.7%。