藁本內酯通過抑制鐵自噬延緩小鼠聽皮層組織衰老

周穎東,張夢嫻,王青玲,康浩然,張治成,王慶林,劉亞敏,郭向東

(1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院, 河南 鄭州 450046;2.河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科, 河南 鄭州 450000;3.河南醫學高等專科學校, 河南 鄭州 451191;4.河南中醫藥大學藥學院,河南 鄭州 450046)

老年性聾是伴隨著衰老而出現的感音神經性聽力損失,其主要病理改變包括：內耳毛細胞丟失、螺旋神經節細胞丟失、血管紋萎縮以及聽覺中樞退化[1]。中樞性老年性聾是由聽覺中樞退化引起的聽力損失,主要臨床表現包括在嘈雜環境中理解語言、定位聲源和處理聲音信息的能力下降,并且會增加認知能力下降和患阿爾茨海默病的風險[2]。中醫認為耳與腦相通,腎精通過腦髓來滋養耳,而氣血瘀滯阻塞耳與腦連接的通道是導致耳聾的病因,因此,中醫常使用活血化瘀的方藥治療耳聾。當歸具有養血調肝以行滯的功效,而川芎具有行氣開郁、活血止痛的功效,當歸與川芎也在眾多治療耳聾的方藥中多次出現[3],藁本內酯(ligustilide, LIG)是當歸、川芎的共同活性成分之一,被發現具有抗炎、抗氧化應激和抗凋亡等藥理學活性,并對多種神經系統疾病如缺血性腦卒中、阿爾茨海默病和神經性疼痛具有明顯的治療效應[4]。然而,LIG是否是治療中樞性老年性聾的活性成分還有待研究。

鐵死亡是一種在形態、生化和基因上有別于凋亡、壞死的全新的細胞程序性死亡方式。Fe2+在細胞內蓄積,產生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)消耗細胞內抗氧化物質,并介導脂質過氧化,誘導細胞死亡[5]。有研究發現,在D-半乳糖誘導的衰老大鼠聽皮層神經元中鐵死亡被激活,說明鐵死亡參與中樞性老年性聾的發病機制,表明干預鐵死亡可能成為中樞性老年性聾新的治療靶點[6],然而,該研究尚停留在初步探索階段。鐵自噬是一種依賴于核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)的選擇性自噬,NCOA4同時結合鐵蛋白與微管相關蛋白輕3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3),將鐵蛋白轉運到自噬-溶酶體降解,并釋放出Fe2+來調控細胞內游離鐵含量[7]。過度激活的鐵自噬可使細胞內游離鐵水平升高,促進鐵死亡,而抑制鐵自噬水平能夠延緩細胞鐵死亡[8]。最近的研究發現,鐵自噬在衰老小鼠的大腦皮層與海馬內被激活,并且可能參與衰老聽皮層鐵死亡的過程[9]。LIG可通過阻斷鐵自噬過程進而抑制鐵死亡,減輕氧糖剝奪再灌注的PC12細胞損傷[10]。因此,LIG在小鼠聽皮層內是否也發揮抑制鐵自噬與鐵死亡的作用,從而保護聽皮層神經元、延緩中樞性老年性聾,值得通過實驗來驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級13月齡C57BL/6J雄鼠40只,同品系2月齡雄鼠10只,購自于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,許可證編號： SYXK(豫)2021-0015。所有小鼠均飼養于清潔級動物房,飼養環境無噪聲。實驗已通過河南中醫藥大學倫理委員會審批。

1.2 實驗藥品與試劑LIG(批號： L8862691)購自上海麥克林試劑公司;DAPI溶液(批號： C0060)、伊紅染色液(批號： G1108)、Mayer蘇木精染液(批號： G1080)、BCA蛋白質濃度檢測檢測試劑盒(批號： PC0020),購自北京Solarbio公司;普魯士藍染液(批號： G1029)、DAB顯色液(批號： G1212-200T)、GAPDH(批號： GB12002),購自武漢Servicebio公司;NCOA4 (批號： DF4255)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4 (Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4) (批號： DF12141);谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase, GPX4) (批號： DF6701),購自美國affinity公司;LC3B(批號： 18725-1-AP)、HRP標記的羊抗兔IgG(批號： SA00001-0),購自美國Proteintech公司。

1.3 實驗儀器和設備電泳儀(DYY-6D,北京六一生物科技有限公司)、電泳槽(DYCZ-24DH,北京六一生物科技有限公司);凝膠成像分析儀(WD9413C,北京六一公司);激光共聚焦顯微鏡(NIKON Eclipse Ti,上海尼康儀器有限公司);聽性腦干反應儀系統(TDT RZ6/BioSigRZ,美國Inteligent Hearing Smart公司);酶標檢測儀(Epoch,美國BioTeK公司);透射電子顯微鏡(HT7800/HT7700,日本hitachi公司)。

1.4 方法

1.4.1動物分組與給藥 自然衰老且聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)檢測示聽閾值明顯升高的13月齡小鼠作為中樞性老年性聾模型,隨機分為LIG低劑量組(L-LIG組)、LIG中劑量組(M-LIG組)、LIG高劑量組(H-LIG組)和衰老組(Age組),2月齡小鼠作為對照組(Ctrl組),LIG組分別按10、20、40 mg·kg-1濃度腹腔注射LIG,Age組腹腔注射等量生理鹽水,每天1次,連續給藥4周。

1.4.2ABR檢測給藥前后小鼠聽閾值 腹腔注射戊巴比妥鈉 (40 mg·kg-1) 麻醉后將記錄電極置于小鼠顱頂正中點皮下,參考電極置于左耳耳后皮下,耳機對準左耳外耳道,地線接右耳耳后皮下,刺激聲為短純音(15 ms刺激音,1 ms間歇),疊加1 024次記錄ABR波形,從90 dB開始,5 dB遞減,直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激強度作為聽閾值。

1.4.3血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測 麻醉小鼠后,摘取眼球取血,全血離心取上清液迅速轉移至-80 ℃冰箱保存,使用全自動生化分析儀檢測血清SOD活力與MDA含量。

1.4.4聽皮層組織病理學染色 冰上取腦,多聚甲醛中固定,根據小鼠腦解剖圖譜[11]確定聽皮層組織所在節段,冠狀面切開,石蠟包埋,切片(厚度4 μm)備用。經烤片,脫蠟,至水,蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水,透明,封片后,在顯微鏡下觀察,參照圖譜確定聽皮層所在區域,觀察并拍攝。

1.4.5透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察鐵死亡情況 冰上分離聽皮層組織并切成1 mm小塊,于電鏡固定液中4 ℃固定過夜,1%鋨酸固定2 h,經梯度濃度酒精脫水,EMBed-812包埋,醋酸鈾與枸櫞酸鉛雙重染色并超薄切片(60～80 nm),TEM下觀察并拍攝。

1.4.6DAB加強法普魯士藍染色觀察聽皮層組織鐵沉積 取聽皮層石蠟切片,烤片、脫蠟,至水,參照試劑盒說明書進行普魯士藍染色。DAB顯色,蘇木素染色,分化,返藍,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察聽皮并拍攝。

1.4.7免疫熒光染色觀察聽皮層組織LC3B與NCOA4共定位 取聽皮層石蠟切片,烤片、脫蠟,至水,檸檬酸鈉抗原修復,阻斷內源性過氧化物酶,BSA封閉, LC3B(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜,次日依次孵育HRP標記的二抗、CY3-TSA,再次進行抗原修復,NCOA4(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜,孵育FITC二抗,DAPI復染細胞核,自發熒光淬滅劑,抗熒光淬滅封片劑封片激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝。

1.4.8Western blot檢測鐵死亡與鐵自噬相關蛋白表達 聽皮層組冰上裂解,離心取上清液,參照 BCA 試劑盒說明書檢測總蛋白質濃度。變性,制膠,上樣(20 μg蛋白質),轉膜,封閉,加入一抗NCOA4、ACSL4、GPX4、 GAPDH(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。次日加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,ECL超敏發光液顯色曝光,使用ImageJ軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 LIG對衰老小鼠的聽閾值的影響如Fig 1所示,與Ctrl組相比,治療前各組小鼠聽閾均明顯上升(P<0.01)。治療后,Age組小鼠聽閾值進一步升高(P<0.01),與Age組相比,M-LIG組和H-LIG組小鼠聽閾值明顯降低(P<0.01),且H-LIG組最明顯,L-LIG組聽閾值無統計學意義。

Fig 1 Auditory threshold shift of mice in each groupbefore and after n=10)

2.2 LIG對小鼠血清中MDA含量與SOD活力的影響如Tab 1所示,與Ctrl組相比,Age組小鼠血清MDA含量升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01)。與Age組相比,L-LIG組和M-LIG組小鼠血清MDA含量與SOD活性無明顯差異,H-LIG組小鼠血清MDA含量降低(P<0.05),SOD活力無明顯差異。

Tab 1 Serum MDA content and SOD activity of mice in each

2.3 LIG對衰老小鼠聽皮層病理學影響如Fig 2所示,HE染色發現,Ctrl組聽皮層中神經元結構完整、排列整齊、細胞形態飽滿、核染色清晰;而Age組小鼠聽皮層神經元數量減少、排列疏松、細胞體積縮小,大量變性的神經元核固縮深染;與Age組相比,L-LIG組、M-LIG組和H-LIG組神經元數量增多、變性的神經元減少、核固縮現象減少。

Fig 2 Morphology of auditory cortex of mouse in each group(×200)

2.4 LIG對衰老小鼠聽皮層細胞超微結構的影響如Fig 3所示,TEM觀察發現,Ctrl組細胞形狀規則,細胞膜結構清晰,胞核規則,染色質分布均勻,雙層核膜清晰,細胞器數量適中,線粒體形狀結構規則。Age組表現出衰老典型改變,胞質局部溶解,胞核不規則,局部內陷,粗面內質網擴張,自噬結構增多,觀察到衰老的線粒體(腫脹,基質局部溶解空泡化,線粒體嵴斷裂縮短)和鐵死亡特征性線粒體(體積變小,膜破損,膜內基質密度變深,嵴減少)。L-LIG組、M-LIG組和H-LIG組未見鐵死亡特征性線粒體改變,胞內可見脂褐素。在L-LIG組觀察到趨于凋亡的細胞,胞體略顯固縮,胞漿密度略深,胞核異型,線粒體明顯腫脹,嚴重者空泡變,粗面內質網擴張明顯,局部脫顆粒。相比于Age組,M-LIG組細胞衰老改變稍輕,H-LIG組細胞衰老改變最輕。

2.5 LIG對衰老小鼠聽皮層鐵沉積的影響如Fig 4所示,Ctrl組聽皮層組織鐵沉積較少,鐵主要集中在細胞外毛細血管內。Age組聽皮層組織可見明顯鐵沉積,鐵聚集顆粒細胞(呈黃棕色或黃褐色)數量明顯增多。與Age組相比,M-LIG組和H-LIG組鐵聚集顆粒細胞數量減少,以H-LIG組減少最明顯。

2.6 LIG對衰老小鼠聽皮層組織鐵自噬的影響如Fig 5所示,激光共聚焦顯微鏡觀察發現,相比于Ctrl組,Age組觀察到部分神經元軸突與胞體內發生NCOA4和LC3B共定位,表明發生了鐵自噬。L-LIG組和M-LIG組也觀察到了共定位現象但程度較Age組輕,而H-LIG組罕見。

Fig 4 DAB enhanced prussian blue iron staining of auditory cortex in each group(×400)

Fig 5 Possible colocalization of NCOA4 and LC3B detected by immunofluorescence(×1 000)

2.7 LIG對衰老小鼠聽皮層組織鐵死亡與鐵自噬相關蛋白表達水平的影響如Fig 6所示,與對照組相比,Age組聽皮層組織GPX4表達明顯減少(P<0.01),ACSL4、NCOA4、表達明顯升高(P<0.01)。與Age組相比,M-LIG、H-LIG組GPX4表達升高(P<0.05),ACSL4、NCOA4表達降低(P<0.01),且H-LIG組最明顯,L-LIG組差異無統計學意義。

Fig 6 Comparison of related protein expression in auditory cortex of mice in each

3 討論

目前對中樞性老年性聾的研究主要集中在線粒體功能障礙、ROS生成異常、氧化應激、線粒體DNA突變和神經細胞凋亡[12]。本研究與以往研究結果一致,衰老小鼠聽閾值明顯上升,血清MDA含量明顯升高、SOD活性降低,并且衰老小鼠聽皮層神經元數量減少、排列疏松、細胞體積縮小,大量變性的神經元核固縮深染,這些結果均符合中樞性老年性聾特征。LIG干預后能有效改善衰老小鼠聽功能,有效延緩聽皮層衰老損傷,且濃度越高療效越明顯,說明LIG能對中樞性老年性聾具有治療作用。

鐵死亡的特征性表現為線粒體體積的縮小,雙層膜密度增加、線粒體嵴減少或消失[13]。本研究通過TEM觀察到衰老聽皮層神經元發生鐵死亡特異性線粒體改變,證實鐵死亡參與聽皮層神經元衰老過程,而LIG干預能夠改善線粒體損傷。在分子層面,鐵死亡受轉運蛋白、酶等多種信號通路的調節。細胞內Fe2+蓄積或氧化還原相關酶的調節異常,都會導致細胞內產生大量ROS并發生脂質過氧化,最終通過多種途徑激活鐵死亡[14]。衰老小鼠聽皮層神經元內鐵含量升高,鐵聚集顆粒細胞數量明顯增多,LIG以劑量依賴性的方式減少鐵聚集顆粒細胞數量。GPX4是細胞中催化脂質過氧化產物還原的主要酶,可以對抗脂質過氧化產物的細胞毒性,維持細胞脂質雙層膜結構的穩定性,然而,隨著鐵死亡過程中谷胱甘肽的耗竭,GPX4的活性發生不可逆抑制。細胞膜表面多不飽和脂肪酸在ACSL4催化下與磷脂結合,形成磷脂化多不飽和脂肪酸,隨后,在花生四烯酸脂氧合酶催化下產生脂質過氧化產物[15]。作為脂代謝中重要的酶,ACSL4在鐵死亡過程中升高[16]。結果顯示,衰老小鼠聽皮層組GPX4的表達水平明顯降低、ACSL4的表達水平明顯升高,LIG干預能升高GPX4并降低ACSL4的表達水平,并且隨著LIG的濃度的升高,效果越明顯。

既往研究表明,抑制NCOA4介導的鐵自噬通過降低游離鐵濃度抑制鐵死亡[17],并且,在衰老小鼠的大腦皮層與海馬內,NCOA4的表達水平明顯升高[9]。與之前的研究一致,通過免疫熒光染色,在共聚焦顯微鏡下觀察到NCOA4與LC3存在空間共定位,提示NCOA4與LC3發生相互作用,聽皮層神經元發生鐵自噬。Western blot結果也顯示,與對照組相比,NCOA4的表達水平明顯升高,提示鐵自噬在聽皮層激活,并且NCOA4的表達水平隨LIG濃度的升高而降低,說明LIG可能是通過抑制鐵自噬發揮鐵死亡抑制作用的。

綜上所述,LIG能夠通過下調聽皮層神經元鐵自噬,抑制鐵死亡,延緩聽皮層組織衰老,改善中樞性老年性聾小鼠的聽功能,因此調節鐵自噬可作為中樞性老年性聾潛在的治療靶點。