枸杞籽油對亞急性衰老大鼠睪丸Nrf2/ARE通路和氧化損傷的影響

田瑞瑩,邢莎莎,虎 娜,馬文欣,劉 暢,劉自鈺,馬 彪,李佳陽,劉虎軍,白長財,陳冬梅,馬會明

(寧夏醫科大學 1.生育力保持教育部重點實驗室、2.基礎醫學院、3.臨床醫學院、4. 藥學院、5.總醫院寧夏干細胞與再生醫學重點實驗室, 寧夏 銀川 750004)

枸杞(Lyciumbarbarum)是“藥食同源”的道地藥材,具有降血壓、抗氧化、抗衰老等功效[1-2]。枸杞籽油(Lyciumbarbarumseedoil,LBSO),是枸杞籽經過CO2超臨界萃取所得的一種功能油。已有報道LBSO可緩解UVB誘導的HaCaT的光損傷[3]、減輕氧化應激[4]、改善抑郁行為及認知功能障礙[5]。

機體衰老進程中伴隨著器官功能的退化,其中睪丸的衰老可引起男性生殖功能障礙及相應癥狀,嚴重影響中老年男性的生活質量[6]。睪丸衰老時發生形態結構退行性病變,如睪丸重量減輕,生精細胞散在分布,支持細胞稀少,精子數目遞減[7]。同時也伴隨著睪丸功能的減退,如血清激素水平變化和精液質量(精子數量、精子活力)下降等[8]。研究證實衰老產生過多活性氧和自由基,引起機體氧化應激損傷,出現衰老[9],進而睪丸組織也會受到影響。已證實核轉錄因子E2相關因子2(NF-E2-ralated factor 2,Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant responsive element,ARE)通路在維持機體細胞內氧化還原狀態平衡和降低氧化應激造成損傷具有重要作用[10]。本課題組前期研究證實LBSO對D-半乳糖(D-galactose,D-gal)處理的衰老的睪丸支持細胞和衰老大鼠有明顯的抗炎作用[11],但目前關于發揮抗衰老作用鮮有報道。因此本研究旨在探索LBSO是否可以通過Nrf2/ARE通路抑制亞急性衰老大鼠氧化應激和清除氧自由基,進而改善衰老或減緩衰老進程。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級8周齡♂SD大鼠60只,動物許可證號：SCXK(寧)2020-0001,體質量(200±20)g,購自寧夏醫科大學動物中心,實驗動物福利倫理審查編號No. IACUC-NYLAC-2020-007,所有大鼠分籠飼養于濕度56%～65%,溫度(20±3)℃的環境中,自由攝食和飲水。

1.2 藥物LBSO執行標準：Q/QMSW0001S,購自寧夏杞明生物食品有限公司。

1.3 試劑D-gal(美國Sigma公司,貨號：G0750,純度>99%);鹽酸二甲雙胍片(metformin,Met;中美上海施貴寶制藥有限公司,批號：國藥準字H20023370,規格：0.5 g);β-半乳糖苷酶(β-gal)、Lamin B、β-actin、SOD2、NQO1以及GCLC抗體(北京博奧森公司,貨號：bs-13369R、bs-1840R、bs-0061R、bs-20668R、bs-23407R、bs-23393R);p16INK4A、p21Waf1/CiP1和p53抗體(沈陽萬類公司,貨號：WL01418、WL0362、WL01919);Nrf2抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號：AF0639);GAPDH、山羊抗小鼠-IgG抗體和山羊抗兔-IgG抗體(北京Lablead公司,貨號：G0100、S0100、S0101);γH2AX抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號：60566);蛋白電泳試劑(上海雅酶生物科技有限公司,貨號：LK304);BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物公司,貨號：KGP902);細胞、組織核蛋白提取試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司,貨號：26131);ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號：E-OSEL-R0003、E-EL-0060c、E-BC-K030-M、E-BC-K022-M);通用二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號：PV-9000)。

1.4 儀器全自動冷凍研磨儀(JXFSTPRP-CL型);雙目正置熒光顯微鏡(BX-51,日本奧林巴斯);蛋白電泳裝置(Mini-PROTEAN Tetra型,美國Bio-Rad公司);全波長酶標儀(EPoch型,美國BioTek公司);化學發光凝膠成像儀(ChemiDoc XRS,美國 Bio-Rad公司);石蠟包埋機(KD-BM II型,中國KEDEE公司);石蠟切片機(RM2235型,德國Leica公司);切片掃描儀(APerio LV1型,德國Leica公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1動物分組以及處理方式 采用隨機數字法,將大鼠分成空白對照組(Control)、模型對照組(Model)、LBSO低劑量組(1 000 mg·kg-1)、LBSO中劑量組(1 750 mg·kg-1)、LBSO高劑量組(2 500 mg·kg-1)和陽性藥物二甲雙胍對照組(Met,300 mg·kg-1),每組10只。除空白對照組,其他各組通過D-gal(125 mg·kg-1)頸部皮下注射8周,建立亞急性衰老模型,給藥劑量按照本課題組文獻[4]報道;在皮下注射4周時,LBSO低、中和高劑量組繼續注射D-gal并同時灌胃LBSO 1 000、1 750、2 500 mg·kg-1,陽性藥物對照組繼續注射D-gal并同時灌胃二甲雙胍300 mg·kg-1,灌胃共持續4周,至第8周注射D-gal和灌胃同時結束,開始取材收集各組睪丸組織和血清。

1.5.2血清氧化相關因子水平以及血清激素水平ELISA法測定 取大鼠心臟血液,室溫靜置30 min后,4℃條件下10 000 r·min-1離心15 min后取上清,采用ELISA法檢測獲得血清樣品中氧化相關因子氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)以及激素睪酮(testosterone,T)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH)的水平,按試劑盒說明書中的步驟進行標準品制備、加樣、抗體孵育等操作,加入終止液后,酶標儀在450 nm波長下檢測每孔吸光度值(A值)。

1.5.3HE染色觀察大鼠睪丸組織的形態學變化 將取下的大鼠一側新鮮睪丸立即置于4%多聚甲醛中固定24 h后,將睪丸取出,在睪丸中間以及睪丸兩側進行表膜扎孔以便固定液更好滲透進睪丸內部,再放入固定液中固定48 h后,經梯度乙醇、二甲苯脫水浸蠟后行石蠟包埋,制備成5 μm石蠟切片后,65 ℃烘烤3 h,切片脫蠟復水后,HE染色,乙醇脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下,觀察睪丸組織的形態和結構的變化。

1.5.4免疫組織化學染色 將睪丸組織石蠟包埋切片后,進行脫蠟、復水、抗原修復、一抗孵育(Nrf2、GCLC、NQO1、SOD2、β-gal和γH2AX抗體稀釋倍數均為1 ∶200)、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察,可以看到組織內細胞呈現棕黃色或者是棕褐色,即為陽性表達區域。運用低倍鏡和高倍鏡調整觀察染色情況。

1.5.5睪丸組織總蛋白和核蛋白提取 依據細胞、組織總蛋白和核蛋白提取試劑盒步驟,取50 mg經PBS潤洗的睪丸組織,加入500 μL Hypotonic Buffer置冰上勻漿20次,收集勻漿,置4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min后靜置30 min,待分層后吸取上清至預冷的塑料管中,即為抽提得到的總蛋白。向沉淀中加入70 μL添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑Extraction Buffer高速劇烈渦旋,每隔1～2 min高速劇烈渦旋15～30 s,再置冰上孵育共30 min,后于4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min后取上清,即為抽提得到的細胞核蛋白,用于Nrf2核蛋白分析和檢測。

1.5.6Western blot檢測p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1和SOD2總蛋白及Nrf2核蛋白水平 取上述提取的組織總蛋白和核蛋白,使用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。按照文獻[9]的具體方法,蛋白變性SDS-PAGE電泳、轉膜、室溫封閉,加入一抗(p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1、SOD2)均(1 ∶1 000)、β-actin(1﹕5 000)和Nrf2核蛋白(1 ∶1 000)、核內參Lamin B(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜。加入對應二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h,后使用ECL發光液進行抗原抗體檢測。用ImageJ對結果進行灰度值分析。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 亞急性衰老模型大鼠的鑒定形態學結果顯示,空白對照組大鼠睪丸組織中,精曲小管大小形狀正常,管壁完整,內部各級生精細胞排列緊密整齊有序,精曲小管中心明顯可見精子;衰老模型組睪丸組織中,精曲小管管壁扭曲變形,各級生精細胞排列稀松、疏散且無序,二者差異明顯。免疫組化β-gal染色結果顯示,與空白組相比,衰老模型組睪丸組織中β-gal陽性表達升高(Fig 1A)。與空白對照組比較,衰老相關蛋白p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX在衰老模型組的表達明顯上調(P<0.05),差異有統計學意義(Fig 1B)。確定D-gal皮下注射成功制備了亞急性衰老大鼠模型。

2.2 LBSO對亞急性衰老大鼠睪丸組織形態學的影響與衰老模型組相比,LBSO各劑量組睪丸組織精曲小管管壁較完整,較相鄰精曲小管聯系緊密,形態未見明顯扭曲,各級生精細胞排列較整齊有序,中心可見正常精子(Fig 2);間質細胞中β-gal表達陽性表達降低;支持細胞中γH2AX陽性表達降低(Fig 3-6)。

Fig 1 Identification of rats with subacute aging models n=3)

Fig 2 Effect of LBSO on testicular histomorphology in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 3 Effect of LBSO on markers of testicular aging β-galactosidase in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 4 Effect of LBSO on oxidative factor p16 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 5 Effect of LBSO on oxidative factor p21 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 6 Effect of LBSO on markers of testicular aging γH2AX in subacute aging rats (bar=50 μm)

2.3 LBSO對Nrf2蛋白表達的影響免疫組化結果顯示,與模型組相比,LBSO各劑量組睪丸組織的支持細胞中Nrf2核表達陽性升高(Fig 7)。

Fig 7 Elevated expression of Nrf2 protein nuclei in testicular tissue of subacutely aging rats (bar=20 μm)

2.4 LBSO對Nrf2/ARE通路相關蛋白表達水平的影響Western blot結果顯示,與衰老模型比較,LBSO各劑量組Nrf2/ARE通路相關蛋白Nrf2、GCLC、NQO1和SOD2的表達均明顯上升(P<0.05),差異具有統計學意義(Fig 8)。免疫組化結果顯示,與衰老模型比較,LBSO各劑量組Nrf2/ARE通路相關因子GCLC、NQO1和SOD2的表達水平陽性表達升高(Fig 9-11)。

Fig 8 Effect of LBSO on expression of Nrf2/ARE pathway correlated factors in testis tissue of subacute aging rats n=3)

Fig 10 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor NQO1 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

Fig 11 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor SOD2 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

2.5 LBSO對血清中氧化相關因子的影響ELISA檢測氧化因子結果顯示,與空白組相比,模型組血清SOD和GSH水平均明顯降低,MDA水平明顯增加(P<0.05),差異具有統計學意義;與模型組相比,經不同濃度LBSO和陽性藥物Met干預后,血清中SOD和GSH水平均有明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05),差異具有統計學意義(Tab 1)。

Tab 1 Detection of oxidation factor levels in serum of rats in each group after LBSO treatment n=10)

2.6 LBSO對各血清中激素水平的影響ELISA結果顯示,與空白組相比,模型組血清T和FSH水平均有明顯降低,LH水平明顯增加(P<0.05),差異具有統計學意義;與模型組相比,經不同濃度經LBSO和陽性藥物Met干預后,血清T和FSH水平均有明顯升高,LH水平明顯降低(P<0.05),差異具有統計學意義(Tab 2)。

Tab 2 Detection of hormone levels in serum of rats after LBSO treatment n=10)

3 討論

睪丸作為對外源性因素極其敏感的組織器官,隨著年齡的不斷增加,其生殖生理功能逐漸衰退,隨之也出現組織形態學和功能性的變化[12]。本研究采用D-gal制備的大鼠衰老模型,其睪丸組織形態學上出現生精細胞層數減少,各細胞之間的間隙變大,各級生精細胞都有不同程度的脫落,結果與李夢婷等[13]研究結果一致。HE與免疫組化結果顯示,LBSO干預組睪丸組織精曲小管管壁較完整,較相鄰精曲小管聯系緊密,形態未見明顯扭曲,各級生精細胞排列較整齊有序,中心可見正常精子;間質細胞中β-gal表達陽性表達降低;研究結果顯示,模型組中衰老相關的生物標志分子p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX蛋白的表達明顯上調,D-gal處理加速了衰老相關的生物學改變進程,這一亞急性衰老所致睪丸損傷結論與衰老相關生物學所述的損傷研究[14]的結論一致。p21是一種細胞周期調節因子,它處于p53上下游,可以透過與p53結合,控制損傷DNA的恢復和累積[15],作為細胞中感應DNA損傷最敏感的分子組蛋白變體H2AX(形成γ-H2AX)開始圍繞損傷點聚簇。推測LBSO干預可能會降低機體及細胞的氧化損傷所致的衰老,進而保護睪丸損傷。睪丸組織各細胞也會因為D-gal處理出現適應性反應,出現組織或細胞衰老現象,導致細胞周期改變,產生細胞的氧化應激反應。組織或細胞中氧化酶SOD、GSH和MDA等和DNA的活性改變,進而生成大量超氧陰離子以及氧化產物,會造成生物大分子結構以及機體組織功能的損傷,最終引起機體以及細胞的老化[16]。本實驗ELISA檢測結果表明,LBSO治療組和陽性藥物治療組血清SOD和GSH水平有明顯上升,MDA水平明顯下降。這與SOD和GSH抗氧化、抗衰老、清除自由基的生理功能,起到中和毒性的作用,MDA間接地反映膜脂過氧化程度的作用等[17]理論是相符的。同時,衰老過程中多種激素水平出現異常或者細胞對激素的敏感性亦有所降低。當LBSO和陽性藥物治療時,下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)調控垂體LH的分泌,而LH可促進睪丸間質細胞合成和分泌睪酮[8],促進生精細胞的發生和發育,抑制生精細胞凋亡。分泌過多的睪酮可進入血液循環系統到達垂體抑制LH與FSH的分泌,部分經類固醇合成酶催化合成E2,后者再進行負反饋調節[18-19]。本實驗研究結果顯示,LBSO治療組和陽性藥物治療組血清激素睪酮和FSH含量明顯升高,LH含量明顯降低。可能是因為LBSO通過下丘腦-垂體-性腺軸對睪丸的生殖功能發揮調節作用。Nrf2作為調控抗氧化反應和氧化損傷的一種關鍵轉錄因子[20],在誘導機體的抗氧化應答中起著重要作用,如調節氧化還原平衡、DNA修復和線粒體生理機能等。Nrf2通路的活化可上調多種抗氧化基因表達,降低組織氧化損傷[20]。在衰老過程中Nrf2通路以及靶基因均有表達降低的趨勢,本研究結果顯示,LBSO治療組和陽性藥物治療組可明顯提高亞急性衰老大鼠睪丸中Nrf2通路及其下游靶分子GCLC、SOD2和NQO1的蛋白表達水平,這可能是LBSO通過激活衰老睪丸組織中Nrf2通路,發揮抗氧化損傷的保護作用,進一步保護氧化損傷所致的睪丸組織衰老。綜上所述,本研究通過成功構建亞急性衰老大鼠模型,觀察到LBSO可以減輕亞急性衰老大鼠睪丸形態結構損傷,降低氧化應激,改善生殖激素的紊亂。LBSO可能是通過上調Nrf2信號通路及其下游GCLC、SOD2和NQO1的表達水平,達到改善衰老大鼠睪丸氧化應激的作用。本研究為LBSO保護睪丸、抵抗睪丸衰老、提高睪丸功能提供了一定的理論依據。但LBSO在衰老大鼠睪丸組織中發揮抗氧化應激作用,是否是直接激活Nrf2信號通路,是否是多靶點共同發揮作用,是否是通過其他通路共同發揮抗氧化作用,這些問題需要進一步深入開展研究。