基于YWHAZ/p38MAPK/CASP3信號(hào)通路探討軟脈煎治療動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制

趙 雪,顧 耘,張 璐,杜文婷

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海 200032)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認(rèn)為是一種進(jìn)行性血管慢性炎癥性疾病,也是世界上心血管疾病致死的主要原因之一[1]。前瞻性研究表明低密度脂蛋白與缺血性心臟病死亡率之間存在著強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系,國(guó)際公認(rèn)的針對(duì)性治療藥物——他汀類已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床[2]。但是AS是一個(gè)復(fù)雜的生理、病理過(guò)程,單一作用靶點(diǎn)并不能完全滿足臨床預(yù)防和治療的需要,目前中醫(yī)藥多靶點(diǎn)干預(yù)在AS治療方面展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。

中藥復(fù)方軟脈煎(RMJ)是上海名中醫(yī)顧耘教授的經(jīng)驗(yàn)方,由熟地黃、黃芪、陳皮、肉蓯蓉、荷葉、絞股藍(lán)6味中藥組成,方中熟地黃、黃芪補(bǔ)益精氣,陳皮理氣健脾、燥濕化痰,荷葉升陽(yáng)利濕、散瘀止血,絞股藍(lán)健脾益氣、清熱解毒,肉蓯蓉補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血。前期課題組已證實(shí)RMJ可以保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血管平滑肌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)血脂、減小頸動(dòng)脈斑塊面積及改善臨床癥狀[3]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),我們可以從大數(shù)據(jù)中識(shí)別藥物與疾病的靶點(diǎn),進(jìn)一步探究其作用機(jī)制和相關(guān)通路[4]。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1RMJ藥物活性成分及靶點(diǎn)收集 采用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology),搜索RMJ中熟地黃、黃芪、陳皮、肉蓯蓉、荷葉、絞股藍(lán)6味中藥的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),隨后根據(jù)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)參數(shù)(ADME)進(jìn)行篩選,設(shè)置生物利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18。

1.1.2“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Uniport(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,利用軟件Cytoscape3.8.2繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.3疾病靶點(diǎn)收集 以“Atherosclerosis”為關(guān)鍵詞在DrugBank(https：//go.drugbank.com/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM (online mendelian inheritance in man)網(wǎng)站進(jìn)行檢索,獲得AS的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助Cytoscape3.8.2軟件中的插件Bisogenet將藥物活性成分靶點(diǎn)和AS疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入并“merge”兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)獲得交集網(wǎng)絡(luò),對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?連接度、緊密度等),獲得核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將RMJ治療AS的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入David(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

1.2 分子對(duì)接采用Seesar軟件將排名關(guān)鍵成分分別與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算其結(jié)合能力,根據(jù)親和度排序,篩選出親和度值小于1 000 000 nm的成分。使用基于結(jié)構(gòu)的建模支持服務(wù)器(https：//proteins.plus/)展示對(duì)接結(jié)果的3D、2D結(jié)構(gòu)。

1.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1實(shí)驗(yàn)材料 ①動(dòng)物：SPF級(jí)ApoE-/-C57BL/6J小鼠30只,C57BL/6J小鼠10只,8周齡,雄性,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào)20210006。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度(24±2) ℃,濕度65%～75%,設(shè)置12 h光暗循環(huán),自由飲水。C57BL/6J小鼠普飼,ApoE-/-C57BL/6J小鼠高脂飼養(yǎng),高脂飼料由78.85%基礎(chǔ)飼料、21%脂肪、0.15%膽固醇組成,購(gòu)置于上海帆泊生物,合格證號(hào)：(2022)05005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物福利與倫理相關(guān)規(guī)范,倫理編號(hào)：PZSHUTCM220926004。②藥物：RMJ顆粒劑(包括黃芪15 g、陳皮6 g、肉蓯蓉12 g、熟地15 g、荷葉15 g、絞股藍(lán)30 g)購(gòu)置于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,生產(chǎn)批號(hào)：21090158,蒸餾水溶解。③試劑：GAPDH抗體(CST,5174),Cleaved caspase3 抗體(CST,9664S),p-p38 MAPK 抗體(CST,4511S) ,YWHAZ 抗體(Santa Cruz,sc-518031) ,預(yù)染蛋白Marker(莫納,PE30301),RIPA裂解液(雅酶,PC101),BCA蛋白定量試劑盒(雅酶,ZJ101),TBSTw(碧云天,ST673)。④儀器：全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命),電泳儀(上海天能科技),蛋白印跡智能成像系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific),病理切片機(jī)(上海徠卡),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendoref),超純水機(jī)(美國(guó)艾肯)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)方法 ①造模、分組和給藥：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,C57BL/6J小鼠(10只)設(shè)為對(duì)照組予普飼,30只ApoE-/-C57BL/6J小鼠高脂飼養(yǎng)12周建立AS模型,隨機(jī)挑選3只取主動(dòng)脈進(jìn)行油紅染色鑒定造模結(jié)果,將AS模型小鼠隨機(jī)分為模型組(9只),RMJ高劑量組(9只),RMJ低劑量組(9只)。將RMJ顆粒劑用蒸餾水配置成混懸液,以70 kg成人等效劑量換算,RMJ高劑量組小鼠每日給藥16.38 g·kg-1,低劑量組每日給藥8.19 g·kg-1模型組和對(duì)照組予等劑量蒸餾水灌胃,灌胃時(shí)間為12周。②觀察指標(biāo)：血脂測(cè)定：末次給藥后禁食12 h摘眼球取血,室溫靜置2 h,4 ℃、3000 r·min-1離心15 min,取上清,全自動(dòng)生化儀自動(dòng)測(cè)定各組血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。主動(dòng)脈病理切片染色：將采血后的小鼠開(kāi)胸暴露心臟,心臟灌注生理鹽水后采用4%多聚甲醛固定,OCT包埋切片后進(jìn)行常規(guī)HE、Masson和天狼猩紅染色。免疫熒光檢測(cè)：主動(dòng)脈病理切片用3%BSA室溫封閉1 h,1 ∶100稀釋Mac2抗體4 ℃孵育過(guò)夜,1 ∶1 000稀釋二抗室溫孵育1 h,1 ∶7 000稀釋DAPI染色15 min,封片,熒光顯微鏡下拍照,ImageJ軟件分析圖像。Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈蛋白的表達(dá)水平：將主動(dòng)脈進(jìn)行研磨、超聲,RIPA裂解液冰上裂解30 min,離心取上清,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,各組濃度配制相同。制膠,上樣(10～30 μg)。電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,1 ∶1 000稀釋一抗4 ℃孵育過(guò)夜,1 ∶1 000稀釋二抗孵育2 h,1 ∶1配制顯影液顯影,ImageJ軟件分析圖像。

1.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊,多組比較用One-way ANOVA單因素方差分析,組間兩兩比較采用Turkey檢驗(yàn);顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1RMJ藥物活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 RMJ通過(guò)TCMSP平臺(tái)共篩選了72個(gè)藥物活性成分,其中熟地黃2個(gè),黃芪20個(gè),陳皮5個(gè),肉蓯蓉6個(gè),荷葉15個(gè),絞股藍(lán)24個(gè),將上述藥物活性成分作用靶點(diǎn)去除重復(fù)項(xiàng)后共得到199個(gè)。

2.1.2AS靶點(diǎn)收集 于DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)以“Atherosclerosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,去重后共得到疾病靶點(diǎn)4129個(gè),將RMJ藥物靶點(diǎn)與AS疾病靶點(diǎn)取交集得到168個(gè)交集靶點(diǎn),用Venny2.1制作韋恩圖(Fig 1)。

Fig 1 Drug-disease targets

2.1.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助Cytoscape3.8.2軟件中的插件Bisogenet將藥物作用靶點(diǎn)和AS疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入并“merge”兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)獲得交集網(wǎng)絡(luò),最終得到107個(gè)核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(Fig 2)。其中Degree值> 55的靶點(diǎn)有7個(gè)：NPM1、HSPA5、YWHAZ、HSPA8、TP53、MCM2、UBC,定義這7個(gè)靶點(diǎn)是治療AS的核心靶點(diǎn)(Tab 1)。

Fig 2 Protein-protein interaction (PPI) network

Tab 1 Key targets

2.1.4GO和KEGG富集分析 將RMJ藥物與AS疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集信號(hào)通路分析,生物過(guò)程(BP)753個(gè),主要有RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正規(guī)調(diào)節(jié)、細(xì)胞質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等,細(xì)胞成分(CC)84個(gè),主要有胞液、細(xì)胞核、核膜、細(xì)胞質(zhì)等。以P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn),并以P值升序排列,篩選出 BP、MF、CC前10個(gè)采用生信網(wǎng)進(jìn)行繪圖分析(Fig 3)。KEGG富集分析得到170條信號(hào)通路,以P<0.05為篩選條件,篩選出前20條通路(Fig 4),主要包括癌癥的途徑、脂質(zhì)和AS、血流剪切應(yīng)力和AS、活性氧(ROS)、炎癥信號(hào)通路等。

Fig 3 Gene ontology (GO) analysis

Fig 4 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis

2.2 分子對(duì)接結(jié)果選擇10個(gè)關(guān)鍵成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、7-O-甲基異木糖醇(7-O-methylisomucronulatol)、諾比列汀(nobiletin)、芒柄花素(formononetin0、柚皮素(naringenin)、阿美巴芬(armepavine)、豆甾醇(stigmasterol)、鄰去甲花堿(o-Nornuciferine)與核心靶點(diǎn)NPM1、HSPA5、YWHAZ、HSPA8、TP53、MCM2、UBC進(jìn)行分子對(duì)接。采用Seesar軟件將關(guān)鍵成分分別與核心靶點(diǎn)的最佳結(jié)合口袋進(jìn)行分子對(duì)接,計(jì)算其結(jié)合能力,根據(jù)親和度排序,篩選出親和度值小于1 000 000 nm的成分如下,docking結(jié)果表明槲皮素、山柰酚、諾比列汀、柚皮素、阿美巴芬、豆甾醇、鄰去甲花堿與核心靶點(diǎn)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力,見(jiàn)Tab 2。Fig 5展示了核心靶點(diǎn)蛋白與關(guān)鍵化合物的分子對(duì)接3D結(jié)構(gòu)。

Tab 2 Protein-molecule binding affinity

Fig 5 Protein-molecule docking 3D structures

2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1主動(dòng)脈HE、Masson、天狼猩紅染色 HE染色結(jié)果示(Fig 6)：與對(duì)照組相比,模型組主動(dòng)脈相對(duì)斑塊面積明顯增大(P<0.01),并且含有更多的泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶;與模型組相比,RMJ高劑量組和低劑量組主動(dòng)脈斑塊面積明顯減小(P<0.01),并且泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶含量減少。Masson、天狼猩紅染色結(jié)果示：與對(duì)照組相比,模型組膠原相對(duì)含量明顯下降(P<0.01);與模型組相比,RMJ高劑量組膠原相對(duì)含量明顯增高(P<0.01或P<0.05),RMJ低劑量組膠原相對(duì)含量增高不明顯(P>0.05)。病理結(jié)果顯示RMJ高劑量組治療效果較最佳,后續(xù)將重點(diǎn)比較RMJ高劑量組(RMJ組)與模型組差異。

Fig 6 Aorta HE, Masson, and picrosirius red staining

2.3.2RMJ對(duì)AS模型小鼠血脂的影響 與對(duì)照組相比,模型組小鼠的TG、TC、LDL-C水平明顯升高(P<0.01或P<0.05),HDL-C水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,RMJ組TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.05),見(jiàn)Fig 7。

Fig 7 TG, TC, LDL-C, HDL-C detection results

2.3.3RMJ對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈Mac2、YWHAZ蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組Mac2(巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)、YWHAZ蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P<0.01);與模型組相比,RMJ組Mac2、YWHAZ蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01或P<0.05),見(jiàn)Fig 8。

Fig 8 Immunofluorescence detection of Mac2 and YWHAZ protein expression

2.3.4RMJ對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈p-p38MAPK、c-CASP3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組p38MAPK磷酸化水平和c-CASP3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01或P<0.05),與模型組相比,RMJ組p38MAPK磷酸化水平和c-CASP3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)見(jiàn)Fig 9。

Fig 9 Western blot detection of p-p38MAPK and c-CASP3 protein expression

3 討論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和分子對(duì)接驗(yàn)證,我們最終獲得了槲皮素、山柰酚、諾比列汀、柚皮素、阿美巴芬、豆甾醇、鄰去甲花堿7個(gè)關(guān)鍵活性成分,其中荷葉含有槲皮素、山柰酚、阿美巴芬、鄰去甲花堿,黃芪含有槲皮素、山柰酚,陳皮含有諾比列汀、柚皮素,肉蓯蓉含有槲皮素,絞股藍(lán)含有槲皮素,熟地黃含有豆甾醇。槲皮素被證實(shí)不僅可以降低血漿和主動(dòng)脈中總膽固醇、總脂肪酸和TG的含量,還可以有效抑制乳糜連接素15脂氧合酶進(jìn)而抑制低密度脂蛋白的合成[5- 6];山柰酚被證實(shí)可以防止異位脂質(zhì)積累[7],槲皮素、山柰酚屬于黃酮類化合物,已有研究證實(shí)黃酮類化合物具有抗炎特性[8];諾比列汀可以通過(guò)增強(qiáng)miR-590對(duì)脂蛋白脂酶表達(dá)的抑制作用來(lái)減輕促炎細(xì)胞因子的分泌和脂質(zhì)積累,進(jìn)而改善血管內(nèi)皮功能[9- 10];柚皮素可以減少斑塊巨噬細(xì)胞并增加平滑肌細(xì)胞[11];阿美巴芬通過(guò)抑制T細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、降低炎癥細(xì)胞因子水平起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[12];豆甾醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝X受體基因表達(dá)降低血清膽固醇水平[13];鄰去甲花堿可能通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁分泌、甘油脂、鞘脂代謝和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路等來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[14]。通過(guò)篩選的關(guān)鍵化合物,我們總結(jié)RMJ可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善血管內(nèi)皮功能、抗炎和調(diào)節(jié)免疫治療AS。

通過(guò)RMJ治療AS的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集信號(hào)通路分析,可以獲得RMJ治療AS疾病密切相關(guān)的生物過(guò)程和信號(hào)通路。在GOBP分析中,顯示RMJ可以干預(yù)AS細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和新內(nèi)膜的形成加重了AS病變的發(fā)展[15],另有研究顯示造血干細(xì)胞增殖可以加速克隆性造血導(dǎo)致AS疾病加重[16];晚期AS斑塊中血管平滑肌細(xì)胞功能受損的原因可能是細(xì)胞死亡或衰老[17];在一項(xiàng)用人類內(nèi)皮細(xì)胞模擬屏障功能受損的研究中,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子刺激后的內(nèi)皮屏障功能減弱[18]。另外,KEGG分析顯示：RMJ治療AS與脂質(zhì)代謝通路、流體剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)、ROS以及TNF、MAPK、PI3K-Akt 、IL-17信號(hào)通路相關(guān)。脂質(zhì)積累是AS的主要病因之一,AS通常與脂質(zhì)代謝異常和高脂血癥相關(guān)[19];已有研究表明,在細(xì)胞成熟期間施加流體剪切應(yīng)力可以有效減少脂質(zhì)積累[20];由過(guò)量ROS引起的氧化應(yīng)激已經(jīng)被證實(shí)為AS的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[21],ROS直接增加炎癥和黏附因子的表達(dá)、氧化低密度脂蛋白的形成等,它們激活泛素通路,降低內(nèi)皮一氧化氮合酶活性,抑制腺苷一磷酸(AMP)蛋白激酶和脂聯(lián)素的激活,所有這些都會(huì)加速AS進(jìn)展[22];已經(jīng)有明確的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明AS是一種慢性炎癥性疾病[23],機(jī)制研究表明,促AS因子(TNF-α)是程序性細(xì)胞清除受損的一種基本驅(qū)動(dòng)因素,由此造成病變血管細(xì)胞和凋亡細(xì)胞碎片病理積累形成慢性炎癥[24];IL-17對(duì)AS具有一個(gè)雙向的影響作用,一方面可以誘導(dǎo)炎癥和細(xì)胞凋亡,另一方面它又可以通過(guò)促進(jìn)纖維帽形成來(lái)穩(wěn)定斑塊[25];PI3K/Akt通路通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的存活、增殖和遷移影響AS的發(fā)展[26];MAPK參與炎癥信號(hào)傳導(dǎo),并響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)、外刺激而促進(jìn)氧化應(yīng)激[27]。通過(guò)GO 和 KEGG 富集信號(hào)通路分析我們總結(jié)RMJ可以通過(guò)抗炎、影響細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減少氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能來(lái)治療AS。

本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了與AS發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的MAPK信號(hào)通路,其中p38MAPK途徑主要作用于炎癥和免疫。前期篩選出的YWHAZ是p38MAPK信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)劑,YWHAZ低表達(dá)可以通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路減少血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生[28],并且YWHAZ涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)[29],EGFR缺失可以限制IL-6和TNF-α的產(chǎn)生、脂質(zhì)攝取進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[30]。CASP3(caspase-3)是細(xì)胞中的一種蛋白酶,通常以未激活狀態(tài)存在。當(dāng)CASP3被激活并自我切割時(shí),會(huì)產(chǎn)生c-CASP3(cleaved caspase-3)。因此,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,c-CASP3的表達(dá)量通常會(huì)增加,因?yàn)镃ASP3的活性增加[31]。炎癥觸發(fā)p38MAPK途徑激活和黏附分子表達(dá)[32],進(jìn)而誘發(fā)凋亡,c-CASP3表達(dá)增高[33]。

我們首次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補(bǔ)腎類中藥復(fù)方RMJ治療AS的作用機(jī)制。核心靶點(diǎn)的探究驗(yàn)證了課題組以往的部分研究成果：RMJ可以抑制對(duì)平滑肌有增生作用的IL-6表達(dá)進(jìn)而改善內(nèi)皮功能[34];在AS晚期通過(guò)Bax/Bcl-2異源二聚體與Bax-Bax同源二聚體競(jìng)爭(zhēng)Bax減少同源二聚體的形成,從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡來(lái)提高斑塊的穩(wěn)定性[35];RMJ早期可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)自噬防治AS,晚期可以促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,抑制過(guò)度自噬穩(wěn)定AS斑塊[36]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RMJ可以通過(guò)下調(diào)關(guān)鍵靶點(diǎn)YWHAZ及p-p38MAPK、c-CASP3調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路,減輕AS炎癥反應(yīng)及炎癥誘發(fā)的凋亡。課題組未來(lái)將繼續(xù)關(guān)注并驗(yàn)證RMJ通過(guò)誘導(dǎo)糖酵解和TIGAR影響細(xì)胞自噬,影響泛素化和細(xì)胞衰老等治療AS的作用機(jī)制。