基于實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)時(shí)間維度特征的體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)新策略

劉芳彤,邢淑雁,劉孝云,葉冬雪,楊 佳,張國(guó)英,容 蓉,4,楊 勇

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院、2.藥學(xué)院、3.實(shí)驗(yàn)中心,4.中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,5.中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,6.山東省中醫(yī)藥抗病毒工程研究中心,山東 濟(jì)南 250355)

肺癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均居癌癥之首,據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2022年全球范圍內(nèi)肺癌新發(fā)病例數(shù)和死亡數(shù)占全部腫瘤的12.5%和21%,肺癌致死數(shù)約占所有腫瘤致死數(shù)的1/5[1]。2022年2月國(guó)家癌癥中心發(fā)布了我國(guó)最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),肺癌占我國(guó)每年新發(fā)癌癥的20.4%,每年癌癥死亡的27.2%,肺癌致死數(shù)約占比所有腫瘤死亡數(shù)的28%,均高于世界平均水平,該腫瘤也是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥[2]。根據(jù)組織病理學(xué)分類可將其分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),NSCLC約占85%。NSCLC又分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌3大亞型。其中,以肺腺癌最常見,在NSCLC中所占比例最高,且多數(shù)患者確診已為中晚期[3]。

化療是目前抗腫瘤治療的常用方式,篩選合適的抗腫瘤化合物是抗腫瘤藥物研究的重要領(lǐng)域,不同腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征不同,對(duì)藥物敏感性也存在巨大個(gè)體化差異,通過(guò)藥物篩選技術(shù)評(píng)估腫瘤細(xì)胞的敏感性和耐受性,可以確定藥物的合適劑量和治療時(shí)間[4]。以MTT、CCK-8為代表的終點(diǎn)法體外篩選仍然是抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的主要手段。化合物與腫瘤細(xì)胞的相互作用是動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,然而目前常用的終點(diǎn)法大都是選擇24 h、48 h等固定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其EC50值[5-6],這種方法存在較大的主觀性或刻板性,無(wú)法全面準(zhǔn)確反映EC50動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,無(wú)法對(duì)給藥時(shí)機(jī)提供參考。實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析(real time cellular analysis,RTCA)技術(shù)是基于貼壁生長(zhǎng)在微電極表面的細(xì)胞狀態(tài)改變引起貼壁電極界面阻抗改變的一種方法,具有非侵入性連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特征,可以記錄完整的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及藥物干預(yù)過(guò)程[7]。由于天然植物化合物庫(kù)是抗腫瘤藥物篩選的重要來(lái)源,有研究報(bào)道黃芩苷、黃芪甲苷及橙皮苷對(duì)于肺癌均具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[8-10]。因此,本實(shí)驗(yàn)基于RTCA技術(shù),以黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷和一線的抗腫瘤藥物順鉑為例進(jìn)行體外抗A549、H1299肺腺癌細(xì)胞活性分析,旨在建立一種反映時(shí)間維度變化特征的EC50評(píng)價(jià)新策略。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑黃芩苷(Z28S11X125952,上海源葉生物科技有限公司),黃芪甲苷(J04M8T30363,上海源葉生物科技有限公司),橙皮苷(K09S11L123847,上海源葉生物科技有限公司),順鉑(101436,MCE),胎牛血清(2022057,Vivacell公司),雙抗(2321127,美國(guó)Gibco公司),DMEM培養(yǎng)液(8120441,美國(guó)Gibco公司),1640培養(yǎng)液(8120207,美國(guó)Gibco公司),二甲基亞砜(D8371,北京Solarbio公司),1×PBS緩沖液(71012000,美國(guó)Biosharp公司),0.25 %胰蛋白酶消化液(2186956,美國(guó)Gibco公司)。

1.2 儀器多功能RTCA儀(艾森生物有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BIO-RAD公司);倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS);十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司);渦旋儀(寧波拓普森)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)液 A549細(xì)胞株(由山東大學(xué)藥學(xué)院免疫研究所張建教授課題組惠贈(zèng));H1299細(xì)胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)。A549細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基：含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%青霉素-鏈霉素混合液(penicillin-streptomycin,P/S)的DMEM完全培養(yǎng)基,H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基：含10%胎牛血清FBS+1% P/S的1640完全培養(yǎng)基。A549細(xì)胞的維持培養(yǎng)基：含2%胎牛血清FBS+1% P/S的DMEM完全培養(yǎng)基。H1299細(xì)胞的維持培養(yǎng)基：含2%胎牛血清 FBS+1% P/S的1640完全培養(yǎng)基。

1.3.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 從液氮罐中取出A549和H1299細(xì)胞凍存管,迅速放入恒溫水浴鍋37℃溫水中,用鑷子夾住輕輕搖動(dòng)使其快速解凍融化,將細(xì)胞凍存管表面噴灑75%醫(yī)用酒精,移入生物安全柜中,吸取細(xì)胞懸液至2 mL離心管中,以1 200 r·min-1離心3 min,棄上清,用含10% FBS和1% P/S的DMEM完全培養(yǎng)基重懸A549細(xì)胞,用含10% FBS和1% P/S的1640完全培養(yǎng)基重懸H1299細(xì)胞,將重懸后的細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)皿中,在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2選擇最佳細(xì)胞接種密度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549、H1299細(xì)胞,將細(xì)胞用胰酶消化后,懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中,吹打成單細(xì)胞懸液。16孔電極板(E-plate 16)每孔中加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液,放入37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中的電極槽(RTCA Station)上檢測(cè)基線。基線檢測(cè)完畢,取出E-Plate 16,每孔加入100 μL不同濃度(2.5×103、5×103、1×104和2×104個(gè)/孔)細(xì)胞懸液,設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。于超凈臺(tái)中室溫靜置30 min后,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中的RTCA Station繼續(xù)監(jiān)測(cè)。每15 min記錄一次細(xì)胞指數(shù)(cell index,CI),連續(xù)監(jiān)測(cè)48 h,觀測(cè)并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,選擇最佳接種密度。

1.3.3RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)天然產(chǎn)物和順鉑的抗腫瘤活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞,將細(xì)胞用胰酶消化后,懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中,吹打成單細(xì)胞懸液。將A549細(xì)胞懸液(1×104個(gè)/孔)接種于E-plate 16,每孔100 μL,置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中的RTCA Station上孵育。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度(約24 h),暫停RTCA,取出E-plate 16,吸棄E-plate 16中剩余培養(yǎng)液,以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照藥,加入用細(xì)胞維持培養(yǎng)基稀釋得到的一系列濃度的順鉑及中藥活性成分藥液,每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔,每孔加100 μL藥液,同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組,將E-plate 16放入RTCA Station中,RTCA繼續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài),每隔15 min記錄一次阻抗,繼續(xù)連續(xù)監(jiān)測(cè)48 h。H1299細(xì)胞同上。

1.3.4數(shù)據(jù)分析 將得到的細(xì)胞完整生長(zhǎng)曲線用RTCA Software Pro進(jìn)行分析,并借助GraphPad Prism、Origin Pro軟件做圖。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞最佳接種密度不同接種密度的A549細(xì)胞增殖曲線如Fig 1A所示。A549細(xì)胞接種密度為2.5×103個(gè)/孔時(shí),CI值在觀察時(shí)間內(nèi)未發(fā)生明顯變化,CI值略有上升;接種密度為5×103細(xì)胞/孔時(shí),CI值48 h內(nèi)緩慢增長(zhǎng),CI值相對(duì)較低,細(xì)胞密度小導(dǎo)致平臺(tái)期時(shí)間較長(zhǎng);接種密度為1×104細(xì)胞/孔時(shí),CI值在24 h內(nèi)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)持續(xù)增長(zhǎng),約24 h細(xì)胞達(dá)到80%融合度,約44 h后進(jìn)入平臺(tái)期;接種密度為2×104細(xì)胞/孔時(shí),10 h內(nèi)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增殖趨勢(shì),10 h后CI值增長(zhǎng)緩慢且28 h后有下降趨勢(shì),推測(cè)因?yàn)榧?xì)胞密度大致使培養(yǎng)基消耗快,細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)而出現(xiàn)死亡。綜上分析,1×104細(xì)胞/孔為A549細(xì)胞最佳接種密度。

H1299細(xì)胞接種密度為5×103細(xì)胞/孔時(shí),CI值0～29 h增長(zhǎng)緩慢,29～48 h細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì);接種密度為1×104細(xì)胞/孔時(shí),在第24 h達(dá)到短暫平臺(tái)期,繼續(xù)生長(zhǎng)至35 h達(dá)到平臺(tái)期;接種密度為2×104細(xì)胞/孔時(shí),20 h內(nèi)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增殖趨勢(shì),20 h后CI值增長(zhǎng)緩慢且35 h后有下降趨勢(shì)(Fig 1B)。綜上分析,1×104細(xì)胞/孔為H1299細(xì)胞最佳接種密度。

Fig 1 The growth curve of A549 cells and H1299 cells at different seeding densities

2.2 不同天然產(chǎn)物及順鉑抗腫瘤活性檢測(cè)RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同天然產(chǎn)物及順鉑干預(yù)后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見Fig 2。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對(duì)A549細(xì)胞與H1299細(xì)胞的抗腫瘤活性均出現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用,隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞增殖曲線CI值降低,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖的作用。

2.3 數(shù)據(jù)分析采用RTCA Software Pro 2.6.0對(duì)每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的EC50計(jì)算,EC50計(jì)算公式為 Sigmoidal dose-response (variable slope)：Y=Bottom+(Top-Bottom))/(1+10^[(logEC50-X)×Hill Slope])。在“Y Axis”中選擇“%Control”即給藥孔相對(duì)于正常對(duì)照孔CI值的百分率,可消除細(xì)胞本身的影響。點(diǎn)擊“Normalization Time”選擇加樣的時(shí)間點(diǎn),可抵消加樣前細(xì)胞生長(zhǎng)的差異。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對(duì)A549、H1299細(xì)胞24 h、48 h單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的EC50值如Tab 1所示。

Tab 1 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells by endpoint method

將加樣點(diǎn)作為0 h點(diǎn),用GraphPad Prism 8.4.2做圖,見Fig 3。Fig 3顯示受試液/藥對(duì)細(xì)胞的EC50在不同時(shí)間點(diǎn)存在波動(dòng)。如順鉑作用于A549細(xì)胞,在藥物干預(yù)后0～24 h,EC50波動(dòng)較大。另外,當(dāng)EC50相對(duì)穩(wěn)定時(shí),需對(duì)其相關(guān)系數(shù)R2進(jìn)行考察。橙皮苷對(duì)A549細(xì)胞的EC50在21.5～48 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,但其在29.75～48 h時(shí)間段內(nèi)的R2<0.9,因此這個(gè)時(shí)間段內(nèi)的EC50值并不準(zhǔn)確。將相鄰4個(gè)點(diǎn)的EC50進(jìn)行線性擬合,以斜率為縱坐標(biāo),時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)作圖,如Fig 4所示。以相鄰4個(gè)點(diǎn)的EC50線性擬合后|斜率|≤1、R2>9為標(biāo)準(zhǔn),選擇連續(xù)時(shí)間段,計(jì)算這一時(shí)間區(qū)間內(nèi)每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)EC50的平均值作為其EC50,表示為Mean±SD。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑作用于A549細(xì)胞,分別在16～48 h、32.25～48 h、21.5～29.75 h及27.5～48 h時(shí)間區(qū)間內(nèi)EC50相對(duì)穩(wěn)定且R2>0.9,黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑作用于H1299細(xì)胞,分別在19.5～48 h、14～48 h、12.75～46.25 h及10.25～48 h時(shí)間區(qū)間內(nèi)EC50相對(duì)穩(wěn)定且R2>0.9,選擇相應(yīng)區(qū)間EC50平均值作為其EC50。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對(duì)A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞帶有時(shí)間維度特征的EC50值如Tab 2所示。

Fig 3 Fitted curve of EC50 values of A549 and H1299 cells treated with different natural products and cisplatin

Fig 4 A549 and H1299 slope of EC50 linear fit for adjacent 4 detection points

Tab 2 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells characterized by time dimension

3 討論

RTCA技術(shù)是將微電子生物感應(yīng)芯片整合在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中,通過(guò)活細(xì)胞與檢測(cè)板孔中微電極相互作用,電阻抗發(fā)生改變,系統(tǒng)將這些信號(hào)轉(zhuǎn)化為特定的參數(shù)-細(xì)胞指數(shù)來(lái)衡量細(xì)胞的狀態(tài)[11]。該技術(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記連續(xù)監(jiān)測(cè)提供細(xì)胞對(duì)不同刺激響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù),如藥物的細(xì)胞毒性[12]、病毒感染引起的宿主細(xì)胞數(shù)量、大小、附著強(qiáng)度和細(xì)胞間黏附力(即屏障功能)的變化等[13],具有操作簡(jiǎn)單,靈敏度高和重復(fù)性好等特點(diǎn)。

A549、H1299細(xì)胞是人NSCLC研究最常用的上皮類型細(xì)胞株,在NSCLC研究中具有一定的代表性。順鉑等鉑類抗癌藥物通過(guò)損傷DNA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,是臨床上治療各種惡性腫瘤的主要化療藥物。有研究報(bào)道,黃芩苷通過(guò)抑制Akt/mTOR通路,體外抑制A549和H1299細(xì)胞的活力、侵襲和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[14]。黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控PKC-α-ERK1/2-NF-κB通路,抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]。橙皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體通路相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白水平,抑制A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)以A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞作為細(xì)胞模型,以天然植物化合物黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷和一線抗腫瘤藥物順鉑為例,采用RTCA技術(shù)監(jiān)測(cè)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的情況,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(Fig 2)顯示黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對(duì)A549細(xì)胞與H1299細(xì)胞的抗腫瘤活性均出現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用。

在進(jìn)行體外抗腫瘤藥效評(píng)價(jià)時(shí)EC50是一個(gè)重要指標(biāo),目前研究多采用MTT、CCK-8等終點(diǎn)法計(jì)算供試品EC50值。胡翔東等[17]在用不同濃度順鉑處理腫瘤細(xì)胞24 h后,MTT法測(cè)定細(xì)胞活力并計(jì)算EC50,順鉑對(duì)A549和H1299細(xì)胞的EC50分別為52.84 mg·L-1和15.53 mg·L-1;鄭海峰等[18]研究黃芩苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響,測(cè)定黃芩苷對(duì)A549細(xì)胞24、48、72 h的EC50值分別為7.38、5.04、3.94 mg·L-1。我們應(yīng)用RTCA Software Pro 2.6.0計(jì)算黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對(duì)A549、H1299細(xì)胞24 h、48 h固定時(shí)間點(diǎn)的EC50值如Tab 1所示,不同時(shí)間點(diǎn)的EC50值存在一定差異。將RTCA實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)的48 h中若干個(gè)時(shí)間點(diǎn)作圖分析,發(fā)現(xiàn)某些受試液/藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的EC50在不同時(shí)間點(diǎn)存在較大波動(dòng)(如Fig 3順鉑干預(yù)A549細(xì)胞),提示終點(diǎn)法檢測(cè)24 h、48 h等某個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)的EC50存在一定主觀性或刻板性,無(wú)法準(zhǔn)確全面反映EC50動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。另外,當(dāng)EC50相對(duì)穩(wěn)定時(shí),有些受試液/藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的EC50的曲線擬合相關(guān)系數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低(如橙皮苷干預(yù)A549細(xì)胞),提示計(jì)算的EC50可靠性降低。因此,本實(shí)驗(yàn)中選用受試藥/液對(duì)腫瘤細(xì)胞的EC50值相對(duì)穩(wěn)定(相鄰4點(diǎn)EC50線性擬合后|斜率|≤1)且曲線擬合相關(guān)系數(shù)>0.9時(shí),計(jì)算此時(shí)間段內(nèi)EC50的平均值作為具有時(shí)間維度特征的EC50(Mean±SD)。如Fig 5所示,在對(duì)應(yīng)時(shí)間維度內(nèi),順鉑對(duì)A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞的EC50值最小,其它提取物對(duì)A549細(xì)胞的EC50從小到大依次為黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷;對(duì)H1299細(xì)胞的EC50從小到大依次為橙皮苷、黃芩苷、黃芪甲苷。不同腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性存在差異,此方法若應(yīng)用于來(lái)源于患者的腫瘤細(xì)胞,可更加直觀的觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性和敏感性,為腫瘤患者的個(gè)性化治療提供參考。順鉑、黃芩苷和黃芪甲苷抗A549細(xì)胞的時(shí)間窗口偏后(起效在30 h左右以后),橙皮苷抗A549細(xì)胞時(shí)間窗口偏前(起效在30 h之前);這些受試液/藥對(duì)H1299細(xì)胞作用時(shí)間窗口差別不大。這些數(shù)據(jù)顯示不同的受試品抗腫瘤有效的時(shí)間段是不一樣的,提示這種不同有效時(shí)間的抗腫瘤藥物可能為臨床兩藥聯(lián)合或多藥聯(lián)合的給藥時(shí)機(jī)提供參考。

Fig 5 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells characterized by time dimension

綜上所述,進(jìn)行體外抗腫瘤藥效評(píng)價(jià)時(shí),基于RTCA技術(shù)采用曲線擬合相關(guān)系數(shù)>0.9、EC50動(dòng)態(tài)變化相對(duì)穩(wěn)定期策略計(jì)算反映一定時(shí)間窗口期內(nèi)帶有時(shí)間維度特征的EC50數(shù)據(jù)用于抗腫瘤活性研究將更加全面、準(zhǔn)確和合理。本研究思路在其他相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)活性評(píng)估中可以借鑒和參考。