分散固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定不同品種柑橘果實不同部位中3種檸檬苦素類似物的含量

秦蕓樺,鐘世歡,陳青俊,王 京,王 岳,葉佳明,陳云義,孫崇德

(1.贊宇科技集團股份有限公司,杭州 310030;2.浙江公正檢驗中心有限公司,杭州 311305; 3.浙江省食品安全重點實驗室,杭州 310009; 4.浙江大學 果實品質生物學實驗室,杭州 310058)

柑橘果實中含有多種有益于人體健康的物質,如維生素、礦物質、纖維素以及類胡蘿卜素、類黃酮、檸檬苦素類似物等次生代謝物質。其中,檸檬苦素類似物是一類含有呋喃環的以異戊二烯為基本結構單元的高度氧化的四環三萜類化合物,是柑橘果實中的重要功能性成分,也是產生苦味的主要物質之一。檸檬苦素類似物具有抗腫瘤、鎮痛、抗炎、除蟲殺蟲、抗氧化性、抗菌、降血糖以及預防心血管疾病等作用[1-4]。

目前,檸檬苦素類似物的檢測方法主要有熒光檢測法[5]、分光光度法[6]、放射性免疫測定法[7]、液相色譜法[8-12]、液相色譜-質譜法[13-14]等。不同品種柑橘果實的不同部位中檸檬苦素類似物的種類和含量具有較大差異性,而上述方法檢測對象多局限于柑橘果實的單一部位,且同時檢測檸檬苦素、諾米林和黃柏酮等檸檬苦素類似物的報道較少;柑橘果實基質復雜,采用液相色譜法測定時,無法準確測定低含量樣品[15];采用液相色譜-質譜法測定時,檢測對象多為干燥樣品和發酵液,缺乏新鮮樣品的相關研究。為實現不同品種柑橘果實的不同部位中檸檬苦素類化合物種類和含量的比較和鑒別,本工作提出了分散固相萃取-液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)同時測定不同品種柑橘果實的不同部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量,可為柑橘果實中檸檬苦素類化合物在食品、醫藥、畜牧業和農業等領域中合理高效的開發與應用提供科學依據與技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260Ⅱ-6495型液相色譜-質譜儀;Centrifuge 5804R型冷凍離心機;MultiReax型渦旋振蕩器;EVAP11型氮吹儀;Milli-Q型純水儀;KH-5000B型超聲波儀。

混合標準儲備溶液:100 mg·L-1,取0.01 g檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標準品,用乙腈溶解并定容至100 mL,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量混合標準儲備溶液,用初始流動相逐級稀釋,配制成檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的質量濃度為0.10, 0.50, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 mg·L-1的混合標準溶液系列。

檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標準品的純度不小于99%;乙腈、丙酮、甲酸均為色譜純;石油醚、硫酸鎂、氯化鈉、二氯甲烷均為分析純;增強型去脂吸附劑EMR-Lipid;石墨化碳黑(GCB);試驗用水為超純水。

30個柑橘果實樣品均采摘于種植基地,包含12個柚類品種(楚門文旦、奧郎布朗科葡萄柚、強德勒柚、脆香甜柚、安江香柚、五布紅心柚、早熟暹羅柚、大庸菊花芯(柚)、金堂無核柚、上杭蜜柚、馬家柚、舒化柚),5個柑類品種[華農本地早(柑)、無籽甌柑、口之津(柑)、沙柑、沅江建柑],8個橘類品種[陽山橘、八月橘、蔓生紅橘、安江紅橘、年橘、川田(橘)、靜岡1080(橘)、白川溫州(橘)],5個橙類品種[伏令夏橙、金山橙、晚熟6號(橙)、江津長葉橙、摩洛哥酸橙]。將各品種果實的油胞層、白皮層、囊衣、果肉進行分離,分別冷凍粉碎后于-18 ℃保存備用。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.0 μm);柱溫35 ℃;流量0.3 mL·min-1;進樣量10 μL;流動相A為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～5.0 min,B為10%;5.0～7.0 min,B 由10%升至25%;7.0～9.0 min,B 由25%升至45%;9.0～12.0 min,B由45%升至75%;12.0～15.0 min,B由75%升至95%,保持3.0 min;18.0～18.5 min,B由95%降至10%。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI+)掃描模式;多反應監測(MRM)模式;鞘氣流量10 L·min-1;干燥氣流量8 L·min-1;干燥氣溫度300 ℃;霧化氣壓力0.21 MPa;毛細管電壓4 000 V;裂解電壓166 V。其他質譜參數見表1,“*”代表定量離子對。

表1 質譜參數

1.3 試驗方法

取5.0 g均質后的樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水,渦旋混勻后加入20 mL體積比5∶5的丙酮-乙腈混合溶液,混勻后超聲提取10 min,以8 000 r·min-1轉速離心5 min,收集上清液。用3 mL水活化2 g EMR-Lipid吸附劑,加至上清液中,渦旋30 s,加入5 g質量比1∶4的氯化鈉-硫酸鎂混合物和15 mg GCB,迅速搖勻,以8 000 r·min-1轉速離心1 min。吸取全部上清液,于40 ℃氮吹至干,殘渣用10.0 mL初始流動相復溶,過0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS測定。

1.4 數據處理

采用Agilent MassHunter軟件進行數據分析和圖譜處理,采用Microsoft Excel 與Origin lab軟件繪制圖表;試驗數據為至少重復測定3次的結果,采用SPSS19.0軟件進行統計分析,采用方差分析進行多組數據鑒定比較,采用Tukey法進行顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

在ESI+全掃描(SCAN)模式下,依次進樣分析1.0 mg·L-1檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的單標準溶液,3種待測物均形成了準分子離子[M+H]+。啟用離子漏斗模塊,在產物離子掃描(Product Ion)和MRM模式分析中選擇定性離子對和定量離子對,同時優化碰撞能量,使各特征離子對的響應達到最大,優化的結果見1.2.2節。

2.2 色譜條件的優化

檸檬苦素類似物的結構相近,在二級質譜中均會產生m/z161子離子碎片,對色譜分離能力有一定要求。試驗考察了ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm , 1.8 μm)、CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.0 μm)、XBridge C18色譜柱(100 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)作為固定相時對3種待測物分離效果的影響。結果顯示:在梯度洗脫條件下,3種化合物均能有效分離,但XBridge C18色譜柱(100 mm× 2.1 mm, 1.7 μm)和ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm , 1.8 μm)對系統壓力要求更高,且分析時間更長。綜合考慮,試驗選擇采用CAPCELL PAK ADME HR色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.0 μm)作固定相。

以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸銨溶液、甲醇-甲酸銨溶液體系作流動相,比較了不同體系下3種待測物的靈敏度和分離度。結果顯示:在ESI+掃描模式下,在水相中添加一定量甲酸能顯著提高待測物的離子化效率,當甲酸體積分數為0.1%時3種待測物的靈敏度和分離度均最佳;在水相中加入甲酸銨也能顯著提高待測物的離子化效率,且增強效果和甲酸的基本相當,但是添加甲酸更為簡便;與甲醇相比,乙腈具有更強的反相洗脫能力,更小的基線噪音,且其極性與待測物的更接近。綜上,試驗選擇的流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液體系。

按照試驗方法分析大庸菊花芯(柚)油胞層,其中的3種檸檬苦素類似物的典型色譜圖見圖1。

圖1 3種檸檬苦素類似物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the 3 limonin analogues

2.3 預處理方法的選擇

柑橘果實中含大量的有機酸、糖類、色素、黃酮等物質,在液相色譜-質譜的離子化過程中會與待測物競爭電子,從而引起較強的基質效應,影響待測物的準確測定。在優化的儀器工作條件下,選擇有效降低基質效應的預處理方法至關重要。檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的極性較弱,基質干擾物質主要是出峰時間相近的脂質等弱極性物質,需要通過優化提取、凈化等條件降低基質干擾。對于天然植物樣品,常用的提取方法有超聲、回流等,常用的提取溶劑主要有甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等[6-13]。基于上述文獻,進行了提取方法、提取溶劑和分散固相萃取吸附劑的優化試驗。

2.3.1 提取方法

以加標舒化柚的油胞層樣品(加標量50 mg·kg-1)為待測對象,試驗比較了分散固相萃取法、超聲溶劑萃取法、回流溶劑萃取法(分別標記為方法1#、方法2#和方法3#)下加標樣品中3種待測物的回收率,結果見圖2。其中:參考文獻[9]進行超聲溶劑萃取,即取經均質的樣品5.0 g,置于250 mL燒瓶中,加入40 mL石油醚(30～60 ℃),于40 ℃超聲脫脂30 min,抽濾后棄去濾液,加入50 mL丙酮,于40 ℃超聲提取30 min,濾紙過濾,濾液氮吹至干,用10 mL 50%(體積分數)乙腈溶液復溶,過0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS分析;參考文獻[10]進行回流溶劑萃取,即取經均質的樣品5.0 g,置于250 mL燒瓶中,加入60 mL二氯甲烷,于50 ℃回流提取1 h,過濾,將濾液于50 ℃旋轉蒸發至干,加入10 mL乙腈溶解殘渣,過0.22 μm濾膜,濾液供LC-MS/MS分析;圖2柱子上方不同字母a, b代表P<0.05水平下的差異有統計學意義。

圖2 不同提取方法下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.2 Recoveries of the 3 limonin analogues under different extraction methods

由圖2可知,超聲溶劑萃取法和回流溶劑萃取法所得3種待測物的回收率均小于60.0%,而分散固相萃取法所得回收率大于80.0%。因此,試驗選擇的提取方法為分散固相萃取法。

2.3.2 提取溶劑

對甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等的提取效果進行考察時發現:以丙酮、二氯甲烷提取時,提取液中存在較多的色素、脂質等共提取物,尤其是油胞層和囊衣部位,后續凈化難度較高;以油胞層為待測對象,以甲醇、乙腈提取時黃柏酮的單次提取回收率小于50.0%;以丙酮和乙腈的混合溶液提取時,3種待測物的提取回收率相對較高。因此,試驗進一步考察了丙酮和乙腈的體積比分別為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1時對2.3.1節加標樣品中3種待測物回收率的影響,結果見圖3。

圖3 不同體積比丙酮和乙腈的混合溶液下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.3 Recoveries of the 3 limonin analogues under acetone and acetonitrile mixed solutions with different volume ratios

由圖3可知,混合溶液中丙酮和乙腈體積比為 5∶5時3種待測物的回收率均大于80.0%,因此試驗選擇的提取溶劑為體積比5∶5的丙酮-乙腈混合溶液。

2.3.3 分散固相萃取吸附劑

分散固相萃取技術凈化效果好、操作簡便、效率高,是色譜分析中常用的凈化手段,常用的吸附劑有十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)、聚酰胺粉、GCB、活性炭、氧化鋁、硅酸鎂、EMR-Lipid等。其中:C18主要用于吸附脂質,親脂類待測物的回收率偏低;GCB主要用于吸附色素,但對具有平面結構的待測物也存在共吸附;氧化鋁包括酸性、中性和堿性氧化鋁,根據其酸堿性的不同,可用來分離不同酸度化合物,其專一性較差;EMR-Lipid是基于體積排阻和疏水相互作用機制來去除脂質的,可吸附脂質中C5及具有更長碳鏈的物質,具有高選擇性、高效率的特點。根據檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的化學性質,試驗考察了分別以C18、中性氧化鋁、EMR-Lipid等3種脫脂型吸附劑凈化時對2.3.1節加標樣品中3種待測物回收率的影響,結果見圖4。其中,不同字母a, b, c代表P<0.05水平下的差異有統計學意義。

圖4 不同吸附劑下3種檸檬苦素類似物的回收率Fig.4 Recoveries of the 3 limonin analogues with different adsorbents

由圖4可知,C18和中性氧化鋁對黃柏酮的吸附較明顯,其回收率僅為57.1%和51.9%,而EMR-Lipid對檸檬苦素、諾米林、黃柏酮均無明顯吸附,且回收率均大于90.0%。因此,試驗選擇的吸附劑為EMR-Lipid。

利用EMR-Lipid吸附劑除脂后,部分樣品需加入適量GCB去除樣品溶液中的色素,因此試驗進一步考察了GCB用量(5,15,30 mg)對2.3.1節加標樣品中3種待測物回收率的影響。結果顯示:加入5 mg GCB時,檸檬苦素的回收率小于60.0%,且樣品溶液顏色較深;加入15 mg GCB時,3種待測物的回收率均大于90.0%,且樣品溶液較為澄清透明;加入30 mg GCB時,樣品溶液完全澄清透明,但共吸附情況顯著,待測物的平均回收率不到40.0%。因此,試驗選擇加入的GCB用量為15 mg。

2.3.4 優化的預處理條件消除基質效應的效果

由于空白樣品溶液無法獲取,試驗以加標舒化柚的油胞層樣品(加標量10.0 mg·L-1)為待測對象,比較了分別以標準加入法[16]和本方法測定時檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回收率。結果顯示:采用標準加入法測定時,檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回收率為93.2%, 94.5%和91.9%;采用本方法測定時,上述3種待測物的回收率為90.5%, 97.1%和92.4%,本方法的回收率和標準加入法的基本一致,均達到90.0%以上,說明上述優化的預處理條件消除基質效應的效果較好。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以各待測物的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,各待測物的質量濃度均在0.10～10.0 mg·L-1內和對應的峰面積呈線性關系,其他線性參數見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限

分別以3, 10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),所得結果見表2,同時與液相色譜法[26]的檢出限進行比較,結果見表2。

由表2可知,本方法的檢出限低于文獻報道方法的,滿足實際樣品的分析需求。

2.4.2 精密度和回收試驗

按照試驗方法對五布紅心柚的油胞層、白皮層、囊衣、果肉等4個部位進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平進行6次重復測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收率試驗結果(n=6)

由表3可知,3種待測物的回收率為83.1%～90.5%,測定值的RSD為2.6%～5.6%,表明該方法具有較好的精密度和準確度,能滿足實際樣品的檢測需要。

2.5 樣品分析

采用本方法對30個品種柑橘果實樣品的不同部位中3種檸檬苦素類似物的含量進行測定,每個部位各測定3次,所得結果見表4。其中,柑類、橘類、橙類等柑橘果實的囊衣部位樣品量較小,無法用本方法進行分離測定,表4僅顯示柑橘果實其他3個部位的結果。

表4 不同品種柑橘果實不同部位中檸檬苦素類似物的測定值

由表4可知,不同品種柑橘果實的不同部位中3種檸檬苦素類似物含量和分布差異顯著。比較不同品種柑橘果實中3種檸檬苦素類似物總含量,由大到小排序依次為柚類、柑類、橙類、橘類品種,其中柚類品種中早熟暹羅柚(1 513 mg·kg-1)、強德勒柚(1 452 mg·kg-1)和舒化柚(1 437 mg·kg-1)中檸檬苦素類化合物的總測定值較高,柑類品種中無籽甌柑檸檬苦素類化合物的總測定值較高,橙類品種摩洛哥酸橙中檸檬苦素類似物總測定值(761 mg·kg-1)較高,而橘類品種靜岡1080(橘)中檸檬苦素類似物總測定值(11.6 mg·kg-1)最低。比較不同部位中3種檸檬苦素類似物的總含量,柚類品種中檸檬苦素類似物主要分布在囊衣部位,柑類、橙類、橘類品種中檸檬苦素類似物主要分布在白皮層和油胞層部位。比較30種柑橘果實中檸檬苦素類似物的種類、柚類中檸檬苦素類似物主要以檸檬苦素、諾米林為主,黃柏酮含量較低;柑類、橙類、橘類中檸檬苦素類似物主要以檸檬苦素為主,黃柏酮檢出率較低。

本工作提出以分散固相萃取- LC-MS/MS同時測定柑橘果實中3種檸檬苦素類似物的含量,有效解決了柑橘果實不同部位的基質干擾,且方法簡便、快速、檢出限低。方法用于30個不同品種柑橘果實的不同部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮等3種檸檬苦素類似物的檢測,檸檬苦素類似物的含量在品種、部位分布上差異顯著。本方法可為柑橘果實中檸檬苦素類似物的鑒別、資源評價及應用開發提供技術支撐。