羅平小黃姜總黃酮提取工藝的優化及抗氧化活性研究

劉靜，劉繼華，葉朋飛，李秋達，張春艷，黃慧福*

1.曲靖職業技術學院 （曲靖 655011）；2.曲靖師范學院 （曲靖655011）

生姜是姜科多年生草本植物姜（ZingiberofficinaleRoscoe）的新鮮根莖，市面上所種植和銷售的生姜品種有面姜、大肉姜、竹根姜、張良姜、小黃姜等20余種。小黃姜在云南種植面積廣泛，主要分布在曲靖、文山、紅河等地，其中以羅平小黃姜品質最佳，且為當地的特色產業及致富產業，曾在2019年入選中國農業品牌目錄。羅平縣地處滇東高原東南部，氣候溫潤，素有“姜之鄉”之稱，所產小黃姜質細纖小，色澤鮮黃，姜味濃郁，截至2021年底，羅平小黃姜種植面積15 667 hm2，為當地農民收入的重要經濟來源[1-2]。《中藥大辭典》中曾記載：小黃姜，性辛溫，味辛辣、微甘、微苦。生姜是生活中不可缺少的調味料，含有姜辣素[3]、黃酮類[4]、多酚類[5]等多種活性物質，具有抗氧化[6-8]、消炎殺菌[9-10]、抑制腫瘤細胞增殖[11-13]、緩解糖尿病并發癥[14-15]等功能。黃酮類化合物為中藥中常見的物質，且為生姜主要的抗氧化成分[16]。

試驗選取液料比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數為單因素，并對所得最優單因素數據進行正交試驗，確定羅平小黃姜中總黃酮的最佳提取工藝，并對小黃姜總黃酮提取液進行體外抗氧化活性研究，為小黃姜的深度開發提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅平小黃姜（購于曲靖農產品批發市場）。蘆丁（純度≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司）；抗壞血酸（分析純，純度≥99.7%，西隴科學股份有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·，純度HPLC＞97.0%）、2,2’-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+·，純度＞98.0%），上海藍季科技發展有限公司；無水碳酸鈉（分析純，天津市登峰化學試劑廠）；過硫酸鉀（分析純，濟南金昊化工有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純，天津市福晨化學試劑廠）；無水乙醇（分析純，天津風船化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

CP214電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；UV-5600PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；XMTD-204數顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司）；XFB-500粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

標準曲線的繪制參照吳存兵等[17]的方法并稍作改進。配制質量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，待用。吸取0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL蘆丁標準品溶液于25 mL具塞試管中，分別加入1.0 mL 5% NaNO3溶液，搖勻放置5 min，分別加入1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻放置5 min，再分別加入10.0 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液，用80%乙醇定容，搖勻后放置10 min，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，制作標準曲線，得回歸方程y=2.668 7x-0.008 5（R2=0.999 6）。

1.3.2 總黃酮提取率的計算

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al(NO3)3發生絡合反應生成黃色鋁絡合物，在堿性條件下顯紅色，510 nm波長下有最大吸收波長，因此可采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法，以蘆丁作為標準品制作標準曲線，以510 nm作為檢測波長測定吸光度，對比蘆丁標準曲線，計算黃酮含量。

稱取10.000 0 g姜粉于500 mL燒杯中并加入一定濃度和體積的乙醇溶液，在一定溫度條件提取一定時間，減壓抽濾，濾液定容于100 mL容量瓶，得待測液，取1 mL待測液，按1.3.1的方法測定吸光度，同時做空白處理，小黃姜中總黃酮的提取率按式（1）計算。

式中：C為提取液黃酮質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數；M為提取黃酮的生姜粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗

選取不同梯度的液料比（15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1 mL/g）、提取溫度（50，60，70，80和95 ℃）、提取時間（1，2，3，4和5 h）、乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%和80%）進行單因素試驗，分析各單因素對羅平小黃姜總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，以液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數（D）為影響因素，進行四因素三水平L9(34)的正交試驗，對小黃姜中總黃酮的提取工藝進行優化。正交試驗因素與水平表見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

1.3.5 小黃姜總黃酮體外抗氧化試驗

運用最優工藝條件對小黃姜中的總黃酮進行提取，以此為母液，配制0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL的黃酮溶液為待測液，進行體外抗氧化試驗。

1.3.5.1 DPPH·自由基清除率的測定

DPPH·自由基清除率的測定方法參照董賀等[18]的方法，并加以改動。取2.0 mL黃酮待測液和相同濃度的VC參照溶液于具塞試管中，配制0.1 mmol/L的DPPH·溶液，向上述試管中加入2.0 mL的DPPH·溶液，室溫下暗處靜置30 min后在波長517 nm處測定其吸光度。DPPH·清除率按式（2）計算。

式中：A1為加入樣品溶液的DPPH·吸光度；A2為未加DPPH·的樣品溶液吸光度；A0為加入無水乙醇的DPPH·吸光度。

1.3.5.2 ABTS+·自由基清除能力的測定

ABTS+·自由基清除能力的測定參照夏雨弘等[19]的方法并加以改動。取ABTS+·自由基溶液（6.6 mmol/L）和K2S2O8溶液（3.2 mmol/L）等體積混勻，避光放置17～22 h，將ABTS+·自由基溶液用無水乙醇進行稀釋，直至吸光度為0.70±0.02。

分別吸取0.2 mL不同濃度的黃酮溶液和相同濃度的VC參照溶液于具塞試管中，加入3.8 mL ABTS+·自由基溶液，混勻于暗處反應5 min，在波長734 nm下測定吸光度。ABTS+·自由基清除率按式（3）計算。

式中：A4為加入樣品溶液的ABTS吸光度；A5為未加ABTS的樣品溶液吸光度；A3為加入無水乙醇的ABTS吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖1所示，液料比15∶1～25∶1（mL/g）時，小黃姜總黃酮提取率逐漸增大，并在25∶1（mL/g）時提取率達到最大4.847%。液料比25∶1～35∶1（mL/g）時，總黃酮的提取率隨之下降。分析原因可能是隨著溶劑體積的增加，小黃姜中的總黃酮已被基本提取出，且可能會浸出其他物質，導致黃酮的提取率下降，且會造成溶劑的浪費[20-21]。因此，最佳液料比為25∶1（mL/g）。

圖1 液料比對黃酮提取率的影響

2.1.2 提取溫度對小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖2所示，提取溫度在50～80 ℃時，小黃姜中總黃酮的提取率逐漸上升，并在80 ℃時達到最大4.272%，隨著提取溫度繼續升高，提取率下降。隨著溫度的升高，分子的運動加快，黃酮類化合物能快速轉移到溶劑中，但溫度高于80 ℃時，黃酮提取率下降，分析可能由于溫度的升高，黃酮類物質的結構被破壞，導致提取率下降[22]。因此，最佳提取溫度為80 ℃。

圖2 提取溫度對黃酮提取率的影響

2.1.3 提取時間對小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖3所示，小黃姜中的提取率隨著提取時間的延長而先上升后下降，并在提取時間2 h時達到最大4.920%。提取時間2～5 h時，總黃酮的提取率逐漸下降，分析原因可能是隨著提取時間的延長，小黃姜粉末中的其他雜質與黃酮類物質存在提取競爭關系，小黃姜粉末中的其他物質也被提取出來，導致總黃酮提取率的降低[23-24]。同時提取時間過長，提取成本增加。因此，最佳提取時間為2 h。

圖3 提取時間對黃酮提取率的影響

2.1.4 乙醇體積分數對小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖4所示，乙醇體積分數40%～70%時，小黃姜中總黃酮的提取率逐漸增大，乙醇體積分數70%時達到最大4.545%。乙醇體積分數70%～80%時，總黃酮的提取率逐漸下降。分析原因可能是高體積分數乙醇提取出非黃酮性成分，造成總黃酮提取率下降[25]。因此，最佳乙醇體積分數為70%。

圖4 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗結果

選取液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數（D）為單因素進行正交試驗，試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果及分析

根據正交試驗結果中極差值分析可知，各因素對小黃姜總黃酮提取率的影響順序為A＞B＞C＞D，即為液料比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數。小黃姜中總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B2C3D1，即料液比25∶1（mL/g）、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h、乙醇體積分數65%。同時，根據最佳提取條件組合進行3次平行驗證試驗，結果取平均值，為4.959%。試驗結果表明在此條件下，提取率最高。

2.3 小黃姜總黃酮體外抗氧化試驗

2.3.1 DPPH·自由基清除率的測定

對運用最佳工藝條件提取到的小黃姜總黃酮溶液和VC溶液進行DPPH·自由基清除試驗，結果如圖5所示。質量濃度0.2～1.0 mg/mL時，VC對DPPH自由基的清除能力增加迅速，隨后趨于平緩；小黃姜總黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力隨著總黃酮濃度的不斷增加而不斷增強，但仍低于VC的對DPPH自由基的清除能力。質量濃度1.0 mg/mL時，小黃姜總黃酮對DPPH·清除力達到最大79.27%。

圖5 小黃姜總黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+·清除率的測定

對運用最佳工藝條件提取到的小黃姜總黃酮溶液和VC溶液進行ABTS自由基清除試驗，結果如圖6所示。隨著質量濃度增大，VC溶液對ABTS+·清除能力上升很快且強于小黃姜總黃酮提取液對ABTS+·清除力。質量濃度在0.2～1.0 mg/mL時，小黃姜總黃酮的質量濃度與對ABTS+·清除力呈現正相關，質量濃度1.0 mg/mL時，小黃姜總黃酮對ABTS+·清除力達到最大91.26%，與VC溶液的清除能力相當。

圖6 小黃姜總黃酮對ABTS+·的清除作用

3 結論

小黃姜為曲靖市羅平縣的特色農產品，辣味充足，風味獨特，獲得海內外消費者的青睞。此次試驗以羅平小黃姜為試驗材料，通過單因素試驗和正交試驗得到小黃姜中總黃酮提取的最佳工藝條件：料液比25∶1（mL/g）、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h、乙醇體積分數65%。在此條件下，小黃姜中總黃酮的提取率達4.959%。體外抗氧化試驗表明，在一定質量濃度范圍內，小黃姜總黃酮溶液的質量濃度與DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力呈正相關，且自由基的最大清除率分別為79.27%和91.26%，表明小黃姜總黃酮提取液具有一定的自由基清除能力，為后續小黃姜的開發利用提供一定依據。