基于網絡藥理學與分子對接技術探討脈管復康片治療動脈粥樣硬化的作用機制*

吳思敏，盛雯，陳春曉，黃雪云，張錦明△，趙玲

1 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405； 2 廣東省中醫院，廣東 廣州 510105

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種初期發病隱匿，中后期危害嚴重的慢性疾病，隨著人口老齡化的不斷加劇，AS發病率明顯上升［1-2］。AS不斷進展可導致血管管腔狹窄，血栓風險增加，繼而引發缺血性中風、心源性猝死等疾病［3］。在全球范圍內，每年約有2000萬人死于該疾病［4］，AS相關心血管疾病是35～70歲成年人的主要死亡原因［5］。2020年美國心臟病學會發表《全球心血管疾病和危險因素負擔1990—2019》顯示，AS導致的死亡占心血管疾病總死亡的3/4［6］。

AS的發病機制具有多樣性、復雜性，近年來針對中藥單體或中藥復方治療AS的多通道、復合調節的機制研究廣受關注。脈管復康片（天津同仕堂集團股份有限公司生產，國藥準字Z12020023）由丹參、雞血藤、沒藥、乳香、郁金組成，具有活血化瘀、通經活絡功效。相關基礎及臨床研究表明脈管復康片可改善下肢動脈硬化閉塞癥患者血流變、踝肱指數以及肢體疼痛、怕冷、麻木、酸脹與間歇性跛行等癥狀，提高治療有效率［7］。但其內在藥理學機制仍在探索中。本研究通過網絡藥理學方法探析脈管復康片治療AS的潛在機制和作用靶點，并通過分子對接技術進行驗證，為下一步的分子機制研究提供參考。

1 研究方法

1.1 脈管復康片活性成分及靶基因篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）對脈管復康片成分及靶基因進行篩選。依次檢索關鍵詞“丹參”“雞血藤”“沒藥”“乳香”“郁金”，選擇“Ingredients”，再根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18進行篩選，得到脈管復康片活性成分。選擇“Related Targets”，獲取脈管復康片所有成分對應的靶基因。使用UniProt數據庫，將收集到的成分靶點轉化為相應的基因名稱，再利用計算機程序語言軟件Strawberry Perl得到所有藥物的活性成分及其對應的靶基因。

1.2 AS相關基因獲取分別在5個疾病基因數據庫：人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、藥物靶標數據庫（therapeutic target database，TTD）、遺傳藥理學與藥物基因組學數據庫（pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB）、DrugBank數據庫輸入關鍵詞“Atherosclerosis”，整合搜索結果，獲得AS相關基因。運用R語言將脈管復康片靶基因與AS相關基因進行匹配，選擇重疊部分作為脈管復康片治療AS的關鍵靶基因，用R語言繪制韋恩圖。

1.3 “藥物-有效活性成分-關鍵靶基因”網絡構建通過Cytoscape平臺，將脈管復康片治療AS的關鍵靶基因與脈管復康片活性成分映射，建立有效活性成分與關鍵靶基因對應關系。創建“有效活性成分”“關鍵靶基因”“屬性”“有效活性成分-關鍵靶基因關系”文件，導入Cytoscape（Version 3.8.2）構建“脈管復康片-潛在活性成分-關鍵靶點-AS”網絡。網絡中的節點代表有效活性成分、關鍵靶基因；邊代表有效活性成分與關鍵靶基因相互作用關系；紅色、黃色、藍色、綠色、紫色分別代表丹參、雞血藤、沒藥、乳香、郁金；用CentiScape計算活性成分度中心性（degree centrality，DC）。節點DC越大該活性成分在網絡中越重要。

1.4 構建蛋白-蛋白互作（protein-protein interactions，PPl）網絡通過STRING數據庫整合已知和預測的蛋白質與蛋白質之間相互作用。選擇“multiple proteins”，輸入關鍵靶基因，選擇“Homo sapiens”進行檢索。選擇高等置信度為0.700，下載蛋白-蛋白相互作用tsv文件。將tsv文件導入Cytoscape，使用cytoNCA插件計算介數中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部平均連接度（local average connectivity，LAC）、網絡中心性（network centrality，NC）值，篩選得到PPI網絡核心基因。BC、CC、DC、EC、LAC、NC值越高說明該節點在PPI網絡中處于越核心的位置。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析在R軟件（Version 4.0.3）安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將脈管復康片治療AS關鍵靶基因轉換成entrez ID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據已轉換的entrez ID，以P＜0.05，Q＜0.05進行關鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

1.6 分子對接分析將“藥物-有效活性成分-關鍵靶基因”網絡圖中DC值最高的前6個有效活性成分與PPI網絡篩選的前4個核心靶基因進行分子對接。化合物2D結構通過PubChem數據庫獲取；靶基因3D結構通過PDB數據庫獲取。使用ChemOffice對化合物2D結構進行3D再處理，Autodock Vina軟件進行活性口袋分析及分子對接，利用Pymol軟件對結果進行輸出優化。

2 結果

2.1 脈管復康片活性成分和靶基因篩選后共獲得157個活性成分，其中丹參65個，雞血藤24個，沒藥45個，乳香8個，郁金15個。對應靶基因丹參2566個，雞血藤1142個，沒藥1425個，乳香659個，郁金1370個，使用Strawberry perl軟件處理獲得238個活性成分對應的靶基因。見表1。

表1 脈管康復片藥物部分活性成分信息（排名前5）

2.2 AS相關基因共獲得AS相關基因2419個。GeneCards中2372個，OMIM中1個，DrugBank中46個，PharmGKB中26個，TTD中22個。與活性成分對應的238個靶基因進行映射，得到活性成分治療AS的153個靶基因。見圖1—2。

2.3 “藥物-有效活性成分-關鍵靶基因”網絡DC排名前6：槲皮素為100，木犀草素為43，柚皮素為28，丹參酮ⅡA為28，刺芒柄花素為21，甘草查爾酮A為20。見圖3。

圖3 脈管復康片-AS-潛在活性成分-關鍵靶點網絡

2.4 PPl網絡首次篩選閾值為DC大于9、BC大于1.273448773、CC大于0.561643836、EC大于0.068733819、NC大于7，LAC大于6.222222222，共有42個節點和428個節點邊緣。再次篩選閾值為DC大于13、BC大于1.17225274725274、CC大于0.76、EC大于0.188819929957389、NC大于11.4999999999999，LAC大于10.6153846153846，第二次篩選結果為20個節點和157個邊緣，核心靶基因包括JUN、STAT3、MAPK1、TP53、CXCL8、Akt1、PTGS2、EGF、FOS、MAPK3、VEGFA、RELA、STAT1、MMP9、IL-1β、MAPK14、EGFR、CCL2、MYC、ICAM1。見圖4。

圖4 脈管復康片-AS靶點PPI網絡

2.5 GO功能富集分析GO富集結果顯示共富集關鍵靶基因2425個。生物學功能主要涉及脂多糖反應、細菌來源分子反應、金屬離子反應氧化應激反應等。分子功能主要涉及配體激活的核受體活性、轉錄因子活性等。見圖5。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析將關鍵靶基因與KEGG通路進行映射，共富集167條通路，根據校正后P值進行排序，選擇前30個進行氣泡圖展示。關鍵蛋白模塊的相關通路主要涉及流體剪切應力和AS、AGE/RAGE、PI3K/Akt等信號通路，提示脈管復康片可能作用于多條信號通路、多個靶點發揮治療AS的作用，其中流體剪切應力和AS通路最顯著，紅色部分是篩選出的靶基因在通路上的作用靶點。見圖6—7。

圖7 流動剪切應力和AS信號通路圖

2.7 分子對接結果度值最高的前6個有效活性成分：槲皮素、木犀草素、柚皮素、丹參酮ⅡA、刺芒柄花素、甘草查爾酮A，分別與PPI篩選的前4個相關核心蛋白（JUN、MAPK1、TP53、STAT3）進行分子對接。配體和受體結合越穩定，結合能越低，結果表明槲皮素、木犀草素、柚皮素、丹參酮ⅡA、刺芒柄花素、甘草查爾酮A與4個核心蛋白結合能均≤-8 kcal/mol，見表2。將結果導入PyMol軟件進行視覺優化，輸出分子對接三維圖，藍色為小分子配體，綠色為大分子受體。見附圖1。

表2 核心活性成分與核心蛋白結合能量（kcal/mol）

3 討論

現代醫學研究發現，AS可由血管內皮損傷、脂質代謝異常、免疫反應發生、血流動力學改變等因素誘發形成［8］。血管內皮細胞作為血管壁的重要組成部分，其損傷所致的異常增殖和凋亡是AS發生、發展的病理生理基礎［9-10］，主要病理表現為粥樣硬化的動脈局部高脂質積聚、纖維組織增生、多泡沫細胞和高炎癥特征［4］。早期血液中單核細胞在血管平滑肌細胞功能受損時遷移至內皮，分化成巨噬細胞，攝入大量脂質，各種因素作用下大量膽固醇酯聚積至細胞轉化成泡沫細胞，而泡沫細胞是AS斑塊形成脂質條紋的特征性標志［11］。瘀血為AS的主要致病因素之一，既是致病的始動因子，又是其病理產物［12-13］。

本研究發現，脈管復康片治療AS與153個靶基因關系密切，其中包括JUN、STAT3、MAPK1等20個核心靶基因。脈管復康片主要通過槲皮素、木犀草素、柚皮素、丹參酮ⅡA、刺芒柄花素、甘草查爾酮A等活性成分發揮治療作用。槲皮素通過調控PI3K/Akt信號通路，減少活性氧的產生，抑制細胞凋亡和炎癥反應，從而抑制高果糖所致AS［14］；木犀草素可通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥，從而保護單核細胞不黏附到內皮細胞［15］，并通過抑制NOX2（還原型輔酶Ⅱ氧化酶的一個亞型）活化阻斷佛波酯誘導的活性氧的產生，從而抑制AS發展［16］；柚皮素通過增加AMP活化蛋白激酶磷酸化水平促進自噬，進而抑制AS中泡沫細胞形成，延緩AS的發生與發展［17］。研究發現［18］，丹參酮ⅡA可能通過下調Yes關聯蛋白磷酸化水平，影響活性氧的產生，對血管平滑肌細胞及血管內皮細胞增殖具有直接調控作用，進而延緩AS進展并發揮心血管保護作用。刺芒柄花素可通過調節Kruppel樣因子4和類固醇受體RNA激活劑的相互作用，抑制AS發展［19］。甘草查爾酮A能抑制MH7A細胞增殖并誘導其凋亡，可能與其促進MAPK通路相關蛋白磷酸化的表達繼而抑制炎癥因子表達有關［20］。

本研究通過GO及KEGG富集分析發現，脈管復康片具有多通路、多靶點治療AS的作用。主要涉及流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE/RAGE信號通路、PI3K/Akt信號通路等。剪切應力代表血流施加在血管壁內皮表面的摩擦力，其在血管生物學中起核心作用，擾動的血流和相關往復運動，低剪切應力通常會上調內皮細胞基因和蛋白，從而促進動脈壁的氧化和炎癥狀態，導致AS［21］。病理狀態下，活躍的氧化應激會在減少一氧化氮合成的同時加快一氧化氮分解，增厚的血管內膜會阻礙一氧化氮向平滑肌擴散［22］。AGE/RAGE信號通路涉及還原型輔酶Ⅱ氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個細胞內信號途徑的激活，通過NF-κB促進血管內皮生長因子表達，特異性促進血管內皮細胞有絲分裂，刺激內皮細胞合成一氧化氮并上調一氧化氮合酶表達，促進新生血管形成。新生血管管壁不完整，通透性強，可為斑塊局部提供養分，是對缺氧的有益補償，進一步促進AS進展［23］。PI3K/Akt信號通路動脈粥樣硬化可促進細胞凋亡相關基因表達升高，加劇血管內皮細胞損傷及單核細胞聚集、分化和凋亡，引起血管平滑肌細胞功能異常及血管異常收縮，在血管內壁早期斑塊的形成過程中至關重要［24-25］。

綜上所述，本研究探析了脈管復康片治療AS的核心基因靶點及信號通路，闡明了脈管復康片多通路、多靶點的潛在治療優勢，為后續脈管康復片治療AS的機制研究奠定了基礎。

附圖1 核心蛋白與活性成分分子對接結果