新疆傳統發酵乳制品調研及其發酵微生物種質資源分析

蔡擴軍，妥彥峰，徐敏,4，羅曉紅,吳林英，尤宏，寇曉萌，牟光慶，鄭志強，李新玲,4*

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；2.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034 ；3.新疆天潤乳業股份有限公司，烏魯木齊 830000; 4.烏魯木齊市奶業協會，烏魯木齊 830000, 5.新疆旺源駝奶實業有限公司，新疆 福海 836400）

0 引 言

我國傳統發酵乳歷史悠久，在新疆、西藏、內蒙古等地區都具有風味豐富、質地優良、營養價值頗高的傳統發酵乳。由于乳源、地區氣候以及發酵菌種等因素使得我國各地區傳統發酵乳的品質具有較大差異。新疆為山脈與盆地相間排列、盆地與高山環抱，被喻稱為“三山夾二盆”[1]，不同區域內的氣候條件差異很大[2]。新疆也是多民族聚居的省區[3]，多數少數民族喜居于水土豐沃的綠洲和山地草原等地區，這里的人們一直保留著飼養牛、羊、馬、驢和駝等動物的習慣，靠自留“引子”自制發酵乳制品[4]。自制發酵乳制品的“引子”歷經牧民世代接種傳承，“引子”中的微生物在長期的自然進化和演變后蘊藏著豐富的發酵菌種資源，是“天然菌種庫”[5]。

但是，隨著鄉村城鎮化和工業科技的發展，傳統工藝不斷被新技術取代，其中極具價值的微生物資源也可能會逐漸消失，因此挖掘并保存新疆地區的傳統發酵乳制品中的微生物菌種資源具有重要意義。鑒于此，本研究對新疆轄區內主要地州及烏魯木齊周邊的鄉村主要飼養牛、馬、驢和駝的牧民自制的傳統發酵乳制品進行了調研，同時采集樣品，并對其中的微生物菌種進行了多樣性分析和初步篩選，以期為后續新疆傳統發酵制品微生物菌種資源的開發和利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 調研與樣品采集

對新疆轄區內12 個地州及烏魯木齊周邊共45個縣165 個鄉村飼養牛、馬、驢和駝的牧民家庭進行了采訪調研，調研內容主要包括咨詢牧民自制發酵乳制品的時間、“引子”的來源、制備材料和方法、用途等內容。采集了483 份連續使用5 年以上“引子”的傳統發酵乳樣品，液體樣品使用250 m L 無菌采樣瓶（200 m L 左右）采集，固體樣品使用無菌采樣袋采集。做好標記，用冰袋和車載冰箱低溫保藏運送至實驗室，進行微生物多樣性分析以及菌株的篩選和分離。

1.2 試劑及藥品

M RS 肉湯培養基，北京陸橋技術有限責任公司；DN easy Pow erSoil Pro Kit 試劑盒，美國Q IAGEN 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 試劑盒，美國Axyen 公司；E.Z.N.A. soil DN A 試劑盒，美國Om ega Bio-tek 公司；瓊脂糖，西班牙Biow est 公司；1,2-二氟苯，上海阿拉丁有限公司；FastPure Bacteria DNA Iso lation Mini Kit、溶菌酶、2 × Phanta M ax M aster Mix、U ltra GelRed，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 儀器

ABI GeneAm p 9700 PCR 儀，美國ABI 公司；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Agilent 7890B-5977A 氣相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫科技公司；M upid 2 p lus 水平電泳儀，日本M upid 公司；C 300 化學發光成像儀，美國Azure biosystem s 公司；DYY-6C 電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.4 發酵乳菌群分析

對新疆傳統發酵乳中細菌多樣性進行分析，使用E.Z.N.A. soil DNA 試劑盒對發酵乳中的細菌進行DNA抽提。并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，使用N anoD rop2000 測定DN A 的濃度和純度。使用通用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTW TCTAAT) 對16S rRNA 基因V 3-V 4 可變區進行PCR 擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s），然后72℃穩定延伸10min，最后在4℃進行保存。利用Illumina 公司的Miseq PE300/N ovaSeq PE250 平臺進行測序。通過fastp[6]（https://github.com/O penGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH[7]（http://www.cbcb.um d.edu/so ftw are/flash，version 1.2.7） 軟件進行拼接：UPARSE[8]軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據97%的相似度對序列進行O TU 聚類，并使用Silva 16S rRN A 數據庫（version 138）進行數據比對。

采用M o lPure Fungal DNA Kit 提取試劑盒對新疆傳統發酵乳中真菌DNA 進行提取。使用通用引物ITS1F（CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2F（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進行擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，35 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃穩定延伸10 min。使用ITS 數據庫進行數據比對。

2 結果與討論

2.1 新疆傳統發酵乳制作環境條件

調研中發現，新疆轄區內12 個地州及烏魯木齊周邊環境條件存在差異，即此次調研的不同地區傳統發酵乳制品制作的原料環境條件不同。表1 列出了本次調研的新疆12 個地區的主要地理條件和制作發酵乳奶源的主要畜種。所調研的不同牧區，環境溫度存在一些差異，會使發酵過程中微生物的代謝產物存在差異。以牛、羊、馬或駝乳作為發酵的原料乳，參與發酵的微生物會存在差異。

表1 新疆不同地區氣候條件和發酵乳特點

表2 新疆不同地區傳統發酵乳篩選主要乳酸菌菌株數量/株

2.2 新疆傳統發酵乳制作方法

新疆12 個不同地州傳統發酵乳的發酵方法有所不同，而發酵乳所用的“引子”均主要為當地牧民世代傳承下來的，并未采用任何商業發酵劑。塔城地區額敏縣邊境某牧區的多戶牧民表示，發酵用的“引子”源自出生幾天內剛死亡的犢牛/羊胃中的乳糜；烏什縣某戶農牧民表示發酵酸奶的初始“引子”為發面酵頭；阿勒泰富海縣有牧民表示“引子”就是把擠出的新鮮奶加入洋蔥放在帳篷內，待其自然變酸。

新疆不同地州傳統發酵乳，其原料乳基本來自家養的牛、馬、駝和驢乳，且發酵乳基本自用，制作時間5~80 年。

新疆不同地州傳統發酵乳的制作方法差別不大，共同特征為：飼養乳畜經手工擠奶后先用紗布過濾，鮮奶在鍋里進行加熱煮沸，待冷卻至不燙手，倒入專門容器內；再加入前一次發酵成熟的發酵乳作為發酵劑，用勺子攪拌勻，蓋上蓋子，天冷時蓋上棉被置于火爐旁，通常在室溫下發酵，待凝乳后，即可食用。馬、駝和驢擠奶經過濾后直接加入上次“引子”常溫自然發酵，前兩天常攪拌，發酵5~7 d 后待酸香味適宜時，即可飲用。在阿勒泰也有部分牧民將駝乳和馬乳經過濾后再煮沸，待冷卻至室溫后，加入上次“引子”在常溫下自然發酵。

專業理論知識與工程實踐結合的課堂教學 在實際的專業課教學中，為了將理論知識與工程實踐相結合，并引入實際課堂教學中，采用以下步驟進行。

草原上不同少數民族制作的傳統發酵乳制品的感官差異很大。發酵牛乳通常看起來凝乳細膩、且輕輕攪拌后呈豆花狀、黏稠提拉呈絲狀、或糊狀有微量氣泡，很少有乳清析出現象；聞起來有焦香味、花香味、或醇香味、多數為常見酸奶的發酵風味；喝起來呈焦香味、有些許尖酸刺激味，多數酸味柔和，少有膻腥、飼草味。存放過程中少有發霉現象，有些牧民家的酸奶存放半年仍可正常食用，存放滿1 年仍無霉變、香味濃郁，嘗微苦。阿勒泰地區的酸駝乳和酸馬乳呈液體狀態，不同于牛羊乳的凝乳狀態。

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 細菌和真菌多樣性分析

采用焦磷酸測序的方法對南疆三地州喀什（KS）、和田（HT）、阿克蘇（AKS）、哈密地區（HM）、與北疆地區塔城（TCEM）、博州（BZ）、伊犁（YL）等地的代表性樣品進行細菌和真菌的生物多樣性分析。

從圖1 中可以看出，新疆傳統發酵乳制品中南疆地區的HM 21 及北疆地區TC_19 地區的細菌微生物多樣性高于其他組。

圖1 細菌香農指數分析

從圖2 中可以看出，新疆傳統發酵乳制品中南疆地區的HM 21、北疆地區的YL_GL_5 組的真菌微生物多樣性同樣高于其他組。

圖2 真菌香農指數分析

從圖3 中可以看出，在多個傳統發酵乳樣品中檢測到的Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus（HTYT、YJS 35、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_CX、YL_YN、YL_ZS、TC_15）和Lactobacillus_helveticus（HM 13、HM 1、HM 4、HM 12、HM 14、HM 17、HM 19、YL_TKS、BZ_W Q_7、TC_10、BZ_W Q_2），是新疆傳統發酵乳的主要優勢菌株；其次含有一定量的Streptococcus_salivarius_subsp_themophilus（HTYT 39、HTYT 42、YJS36、YJS35、AKSW S4、YC 37、KSSL30、YL_CX、TC_15）。

圖3 細菌菌群種水平Bar 圖

從圖4 中可以看出，在多個傳統發酵乳樣品中檢測到的Kluyveromyces_marxianus（HTYT 42、HM 13、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_TKS、YL_ZS）和Geotrichum_bryndzae（YL_CX、YL_GL、YL_YN、YL_ZS、BZ_W Q_7、TC_15、TCEM_19、YJS35、HM 1 和HM 4），是新疆傳統發酵乳的主要優勢菌株；另外一些地區發酵乳中檢測到的Saccharomyces_sp（TC_10、YL_YN）、Dekkera_bruxellensis（YL_TKS）、Issatchenkia_orientalis（HM 12、HM 14）和Candida_sake（HTYT 41、HTYT 42）并不具有普遍性。

圖4 真菌菌群種水平Bar

2.3.2 細菌和真菌差異性分析

圖5 細菌種水平組間差異分析

伊犁（YL_GL_5） 地區的Lactococcus-raffinolactis（P<0.05）、博州兩地區Lactobacillus-kefir（P<0.05）以及塔城地區（TCEM 19）Acetobacter-orientalis（P<0.05）相對豐度明顯多于其他地區。

乳酸菌和酵母菌是傳統發酵乳中發酵劑的主要微生物組成。由乳酸菌主導的乳酸發酵與酵母菌主導的乙醇發酵及其發酵副產物對傳統發酵乳制品風味的形成具有顯著影響。從圖6 中可看出，各新疆傳統發酵乳樣品中普遍存在Geotrichum_bryndzae，而在塔城兩地區的Saccharomyces_sp（TCEM 10）和Candida_sake（TCEM 15） 的相對豐度顯著高于其他地區（P <0.05）；在伊犁（YL_TKS_3、YL_YN_1、YL_ZS_4）地區的Kluyveromyces_marxianus相對豐度顯著高于其他地區（P<0.05）。乳酸菌與酵母共存的模式賦予新疆傳統發酵乳醇厚、清新的口感，使其與商業發酵乳的風味具有明顯差異[9]。乳酸菌通過乳酸發酵途徑水解乳糖產生乳酸，使乳酸化[10]；YL_YN_1 含有豐富的乳桿菌，可促進乳的酸化；Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus，具有良好的產酸能力，是商業發酵乳的首選發酵劑之一[11-12]。Lactobacillus_helveticus為同型乳酸發酵菌種，具有良好的產酸及蛋白水解能力[13]。酵母菌具有良好的蛋白水解能力，對發酵乳的質構和風味具有積極影響[14-15]。與乳酸菌相比，酵母菌對營養要求相對較低，糖、氨基酸、微生物、礦物質、氧氣等基本化合物的存在即可支持酵母菌的生長代謝[16]；而乳酸菌的生長代謝有更多的營養物質需求，這也使得在乳酸菌酵母菌共生的體系中，酵母菌代謝產生的各類氨基酸能夠有效促進乳酸菌生長代謝[17]，乳酸菌與酵母菌在傳統發酵乳中復雜的共生關系和碳、氮代謝途徑相互作用的結果是形成豐富風味的原因。

圖6 真菌種水平組間差異分析

通過以上分析，確定了新疆不同地區傳統發酵乳制品中主要的優勢微生物，包括德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和馬克斯克魯維酵母菌。

2.4 樣品中篩選出的代表性菌株

基于微生物表型技術和糖代謝特性結合基因技術，利用改良培養基M RS 和PDA 從采集的樣品中篩選出乳桿菌、乳球菌、明串珠菌和乳源性腸球菌4 大類菌，其中以植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、發酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌、假腸膜明串珠菌、腸膜明串珠菌亞種、乳源腸球菌中的屎腸球菌、糞腸球菌和耐久腸球菌為代表的乳酸細菌等497 株；篩選出以發酵乳糖的馬克斯克魯維酵母為代表的乳酸酵母及非乳糖釀酒酵母、發酵畢赤酵母、東方伊莎酵母、膠紅酵母、膜醭畢赤酵母、戴爾有孢酵母、漢遜得巴利酵母、乙醇假絲酵母、清酒假絲酵母和白地霉等真菌；并于國內首次發現現未命名的Kazachstania servazzi、Pichia cactophila、Coniocheataceae sp.和Meyerozyma guilliermondil等菌株，共364 株。

從樣品中篩選出的菌屬與微生物多樣性分析結果基本相符，且部分菌株已在企業開始應用研究，將發酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和馬克斯克魯維酵母應用于乳的發酵，獲得了風味、感官及營養較好的發酵乳產品[14,18]。對未篩選出優勢菌種中的嗜熱鏈球菌，分析可能是由于嗜熱鏈球菌不耐酸以致失活或在35 ℃溫度下培養的嗜熱鏈球菌的菌落過小且特征不明顯所致。

一些發酵乳制品存在多菌株參與發酵。副干酪乳桿菌、耐久腸球菌和發酵乳桿菌等普遍應用于希臘奶酪[19]、乳扇[20]和發酵牦牛乳[5]等傳統發酵乳制品中，使其具有豐富的風味成分和有益代謝產物。鼠李糖乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌共同發酵羊乳時，有利于提高發酵乳的質地、并降低乳中的羊膻味[21]。新疆傳統發酵乳中多樣的微生物構成，正是形成其獨特風味的原因。

2.5 新疆傳統發酵乳制品及發酵菌株的安全性

以上所分離的植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、發酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌、馬克斯克魯維酵母均在國家衛生健康委員會（衛生部）發布的可用于食品的菌種名錄中。對新疆傳統發酵乳中的微生物進行了分離保藏，并對部分地區的發酵乳制品中的相應的部分微生物進行了安全性評價，包括對細胞毒性的評價、實驗動物灌胃實驗，未發現所研究菌株和發酵乳具有毒性[14, 18,22]。

在對新疆不同牧區的傳統發酵乳制品進行調研和采集過程中，發現新疆傳統發酵乳是當地人民的日常食品，具有長期的食用史，因此認為其是具有安全性的傳統食品，同時也是開發食品有益微生物的良好資源[23-24]。

3 結 論

對新疆12 個地州及烏魯木齊周邊共45 個縣165個鄉村的傳統發酵乳制品展開了調研，進一步證明了新疆傳統發酵乳制品中蘊含豐富的食品用微生物菌種資源。新疆傳統發酵乳制作過程中不涉及任何商品發酵劑。從新疆傳統發酵乳中共篩選出497 株乳酸菌和364 株酵母菌，并首次發現了假腸膜明串珠菌、漢遜德巴利酵母和巴氏醋桿菌等菌。部分菌株已在企業開始應用研究，開發新疆傳統發酵乳制品的優質菌種資源可為我國發酵乳制品生產提供具有自主知識產權的菌株。