基于生物信息學(xué)研究宮內(nèi)生長受限的免疫機制及中藥預(yù)測

杜志欣 劉岳軒 張一格 江煜 張桐 楊麗萍

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

宮內(nèi)生長受限（intrauterine growth restriction，IUGR）是圍產(chǎn)兒死亡的第二大原因，與多種不良妊娠結(jié)局相關(guān)，同時影響患者兒童期以及成年期的健康，與成年后的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等慢性非傳染性疾病密切相關(guān)［1］。我國2019年《胎兒生長受限專家共識》將IUGR定義為受母體、胎兒、胎盤等多種因素影響，胎兒生長未達到其應(yīng)有的生長潛能，多表現(xiàn)為超聲估測胎兒體質(zhì)量或腹圍低于相應(yīng)胎齡第10百分位數(shù)以下的胎兒［2］。隨著我國二孩政策的開放，IUGR的發(fā)病率日益升高，影響我國的經(jīng)濟發(fā)展與家庭幸福感。目前國內(nèi)外對IUGR發(fā)病機制已有一定研究，包括胎兒、母體及胎盤等，但具體機制仍未明確。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)母胎的免疫耐受在妊娠過程中發(fā)揮重要作用［3］。胎兒和母體的免疫細胞如淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、巨噬細胞等之間的作用是妊娠所必需的［4］。母胎界面的免疫失調(diào)是IUGR、先兆子癇等妊娠疾病發(fā)生的主要原因［5］。從免疫的角度研究IUGR的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為學(xué)者研究的熱點。

本文通過生物信息學(xué)對IUGR胎盤的芯片數(shù)據(jù)進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析，通過R包篩選IUGR胎盤組織與正常胎盤組織之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），對DEGs進行富集分析并尋找出影響IUGR發(fā)病的關(guān)鍵基因，通過關(guān)鍵基因的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析評價關(guān)鍵基因的診斷效能。通過單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法評估24種免疫細胞在IUGR胎盤的相對含量分析，進行關(guān)鍵基因與免疫浸潤的相關(guān)性分析，篩選免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因并對其進行中藥預(yù)測。本研究旨在為IUGR的診斷與治療提供思路和方法，為研究IUGR發(fā)生發(fā)展的分子機制和實驗研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源 以“fetal growth restriction”為關(guān)鍵詞，基于GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）檢索基因表達譜，選擇“Homo sapiens”人類樣本，獲得編號為GSE12216的數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集共包含16個樣本，8個健康對照組及8個IUGR組的胎盤樣本，平臺為GPL2986、ABI Human Genome Survey Microarray Version 2。

1.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理和DEGs的篩選 對芯片數(shù)據(jù)進行處理后，通過“ggplot2”包對質(zhì)量控制后的芯片數(shù)據(jù)進行可視化分析。R語言“l(fā)imma conductor”軟件包對芯片數(shù)據(jù)進行分析，以|log2FC|＞1，P＜0.05作為篩選標準［6］。基于“ggplot2”包，根據(jù)差異表達數(shù)據(jù)繪制火山圖，同時使用“ComplexHeatmap”包繪制基因矩陣熱圖。

1.3 GSEA分析 GSEA分析對數(shù)據(jù)集所有基因進行分析，可以敏感地找到顯著富集的基因集及其變化趨勢。運用R“clusterProfiler”包進行GSEA的基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析［7］，并使用“ggplot2”對富集前5結(jié)果進行可視化，以FDR＜0.25且P＜0.05為篩選標準。

1.4 DEGs功能富集分析及關(guān)鍵基因的篩選 運用R包“GOplot”對DEGs進行結(jié)合log值的GO與KEGG分析［8］。將DEGs輸入STRING（https：//stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫進行蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，選取得分＞0.9的基因通過Cytoscape軟件進行可視化分析。應(yīng)用Cytoscape中的CytoHubba插件的最大集團中心度（maximal clique centrality，MCC）算法找出排名前10的基因定義為關(guān)鍵基因［9］。

1.5 關(guān)鍵基因的ROC分析 對關(guān)鍵基因進行ROC分析，采用R語言的“pROC”包進行數(shù)據(jù)分析，“ggplot2”包用于可視化分析，相關(guān)基因的治療與診斷作用根據(jù)血藥濃度-時間曲線下面積（area under curve，AUC）進行評價［10］。

1.6 免疫浸潤分析 ImmuCellAI（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI/#！/）是科研團隊基于ssGSEA算法開發(fā)的一種T細胞浸潤豐度分析的工具，可以計算24種免疫細胞豐度［11］。通過ImmuCellAI獲得樣本的免疫細胞浸潤情況，使用“ggplot2”包創(chuàng)建了包含24種免疫細胞類型的熱圖。兩組之間免疫細胞的豐度差異通過Wilcoxon秩和檢驗分析比較，以P＜0.05為篩選標準，使用“ggplot2”包進行可視化分析。

1.7 關(guān)鍵基因與免疫浸潤的相關(guān)性分析及潛在中藥預(yù)測 通過Spearman統(tǒng)計分析的方法計算關(guān)鍵基因與免疫細胞豐度之間的相關(guān)性，并通過“ggplot2”包可視化分析［12］。Coremine Medical（https：//coremine.com/medical/#search）用于篩選與關(guān)鍵基因相關(guān)的中藥［13］。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，對中藥進行功效及歸經(jīng)的統(tǒng)計分析，并篩選出現(xiàn)頻次最高的中藥進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

從TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）數(shù)據(jù)庫（口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18）以及BATman（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫篩選活性成分及相關(guān)靶點信息。通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）統(tǒng)一靶點名稱。基于CytoHubba的MCC算法篩選出排列前20的靶點。

2 結(jié)果

2.1 DEGs芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 將基因芯片GSE12216數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)進行標準化處理，并繪制均一化圖（圖1）。結(jié)果顯示，16個樣本數(shù)據(jù)的中位數(shù)基本處于一條線上，表明該數(shù)據(jù)集質(zhì)量可靠，可進行下一步數(shù)據(jù)分析。

2.2 DEGs的篩選 基于GEO數(shù)據(jù)庫將GSE12216中8例正常胎盤樣本和8例IUGR胎盤樣本分為對照組和實驗組進行差異基因篩選，共獲得228個DEGs，其中上調(diào)基因154個，下調(diào)基因74個，熱圖與火山圖如圖2。

圖2 GSE12216的熱圖（A）與火山圖（B）Fig.2 Heat map （A） and volcano map （B） of GSE12216

2.3 GSEA基因富集分析 對數(shù)據(jù)集基因進行GSEA分析，GSEA-KEGG結(jié)果顯示（圖3），IUGR組胎盤基因主要富集于溶酶體信號通路、細胞周期信號通路、鞘糖脂生物合成的血紅蛋白信號通路、類固醇激素生物合成信號通路以及剪接體信號通路。其中，溶酶體信號通路具有最高的標準化富集得分（normalized enrichment score，NES）（NES=1.77，P＜0.001）。GSEA-GO分析顯示（圖4），IUGR胎盤基因顯著富集在趨化因子受體結(jié)合、對趨化因子的反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、有絲分裂DNA復(fù)制以及趨化因子活性，其中，趨化因子受體結(jié)合（NES=-2.06，P＜0.001）。

圖3 GSEA-KEGG分析Fig.3 GSEA-KEGG analysis

圖4 GSEA-GO分析Fig.4 GSEA-GO analysis

2.4 DEGs功能富集分析及關(guān)鍵基因的篩選 對DEGs進行GO功能分析和KEGG通路分析（圖5），GO分析結(jié)果顯示其生物過程主要集中在氧化應(yīng)激、胎盤發(fā)育以及神經(jīng)元發(fā)育等方面；細胞組成主要集中在質(zhì)膜、薄膜筏、膜微區(qū)、突觸后膜等部位。KEGG信號通路富集分析顯示TNF信號通路、IL-17信號通路和NF-κB信號通路顯著富集。將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析，通過Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，通過CytoHubba的MCC算法篩選出10個關(guān)鍵基因：CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB（附圖1，www.immmune99.com）。

圖5 DEGs的GO（A）和KEGG（B）分析Fig.5 GO （A） and KEGG （B） analysis of DEGs

2.5 關(guān)鍵基因的ROC分析 對10個關(guān)鍵基因進行ROC分析（圖6），結(jié)果顯示10個關(guān)鍵基因均AUC＞0.7，提示關(guān)鍵基因的診斷價值良好。

圖6 關(guān)鍵基因的ROC分析Fig.6 ROC analysis of hub genes

2.6 免疫浸潤分析 基于ImmuCellAI進行免疫浸潤分析。熱圖顯示了每個樣本中24種免疫細胞類型（圖7）。豆莢圖顯示了IUGR組與正常組胎盤組織樣本中免疫浸潤細胞的差異（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)在IUGR胎盤組織中自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞明顯增多（P＜0.001）；單核細胞在IUGR組的胎盤組織中減少（P＜0.05）。

圖7 IUGR免疫浸潤熱圖Fig.7 IUGR immune infiltration heat map

圖8 IUGR與正常組胎盤的免疫浸潤差異分析Fig.8 Analysis on difference of placental immune infiltration between IUGR and normal group

2.7 關(guān)鍵基因與免疫細胞浸潤相關(guān)性分析及中藥預(yù)測 相關(guān)性熱圖提示關(guān)鍵基因CSF2、IRAK1、PTGS2、CHUK、CXCL12、CXCL2以及RELB與免疫細胞浸潤有較高的相關(guān)性（圖9）。

圖9 關(guān)鍵基因與免疫浸潤的相關(guān)性熱圖Fig.9 Heat map of correlation between hub genes and immune infiltration

將7個免疫浸潤相關(guān)關(guān)鍵基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫，篩選出潛在中藥，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，共篩選出143味相關(guān)中藥（表1）。將這些中藥進行歸經(jīng)以及功效分析，結(jié)果顯示IUGR免疫浸潤相關(guān)中苷多歸屬肝經(jīng)、肺經(jīng)、腎經(jīng)以及脾經(jīng)，以清熱類和補虛類中藥為主（圖10）。

表1 免疫相關(guān)關(guān)鍵基因及其映射的中藥Tab.1 Immune related key genes and their mapping of traditional Chinese medicine

結(jié)合文獻研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)中藥出現(xiàn)頻次最高的為人參以及黃芩。故篩選上述2味中藥構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)（附圖2，www.immune99.com）。基于CytoHubba插件通過MCC算法篩選排列前20的靶點，結(jié)果提示，人參和黃芩的藥物活性成分參與調(diào)節(jié)TNF、IL6、JUN、TP53以及AKT1等基因，可能成為治療IUGR的潛在中藥。見圖11。

圖11 免疫相關(guān)中藥治療IUGR關(guān)鍵靶點圖Fig.11 Targets of immune-related traditional Chinese medicine in treatment of IUGR

3 討論

IUGR的發(fā)病與母胎免疫系統(tǒng)環(huán)境的異常密切相關(guān)，尋找影響IUGR患者母胎免疫系統(tǒng)環(huán)境中的關(guān)鍵基因或功能對于在分子水平上揭示IUGR的發(fā)病機制具有重要意義，也可為IUGR的早期診斷和新治療策略的制定提供依據(jù)。本研究通過對正常和IUGR胎盤組織進行DEGs分析，篩選出228個DEGs，包括上調(diào)基因154個和下調(diào)基因74個。根據(jù)全基因組的GSEA分析可知，IUGR組胎盤基因的GO富集主要集中在趨化因子及其受體。趨化因子與其受體的相互作用在免疫反應(yīng)、細胞及器官的發(fā)育以及炎癥反應(yīng)等方面均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)趨化因子12及其受體調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜炎癥和胚胎植入的重塑，當失調(diào)時導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局如IUGR和先兆子癇［14］。GSEA-KEGG富集結(jié)果顯示IUGR組胎盤基因主要富集在溶酶體信號通路。溶酶體可以促進免疫反應(yīng)，促進細胞的新陳代謝以及維持細胞穩(wěn)態(tài)等。自噬-溶酶體系統(tǒng)降解蛋白質(zhì)是維持胎盤發(fā)育所必需的，其功能的異常會致使胎盤發(fā)育不良，從而導(dǎo)致先兆子癇或IUGR等不良妊娠的發(fā)生［15］。GSEA分析結(jié)果提示，免疫功能異常與IUGR的發(fā)病密切相關(guān)。

DEGs的KEGG分析顯示DEGs主要富集在TNF信號通路、NF-κB信號通路以及IL-17信號通路。TNF-α是機體免疫應(yīng)答的重要組成，可以激活免疫系統(tǒng)［16］。TNF-α可以調(diào)節(jié)胎兒的生長發(fā)育，其表達的異常會導(dǎo)致胎盤的氧化應(yīng)激以及血管功能障礙，從而導(dǎo)致IUGR的發(fā)生［17］。NF-κB是經(jīng)典的炎癥因子，是免疫應(yīng)答的中心調(diào)節(jié)分子［18］。NF-κB途徑可以誘導(dǎo)分離蛻膜基質(zhì)細胞的凋亡與炎癥，誘導(dǎo)不良妊娠如IUGR的發(fā)生［19］。IL-17是免疫反應(yīng)的重要成員，可以調(diào)控機體免疫系統(tǒng)［20］。在妊娠合并IUGR以及先兆子癇中，IL-17水平升高［21］。綜上所述，已有大量研究表明TNF信號通路、NF-κB信號通路以及IL-17信號通路與IUGR的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，表明本研究對于IUGR的生物信息學(xué)分析結(jié)果可靠。DEGs的功能富集結(jié)果進一步提示，IUGR的發(fā)生發(fā)展與機體免疫功能關(guān)系密切。

通過Cytohubba軟件的MCC算法，研究預(yù)測了與IUGR發(fā)病具有緊密關(guān)聯(lián)的10個關(guān)鍵基因：

CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）可以介導(dǎo)母胎界面的免疫調(diào)節(jié)，參與胚胎生長發(fā)育［22］。白細胞介素1受體相關(guān)激酶1（interleukin 1 receptor associated kinase 1，IRAK1）在流產(chǎn)患者中表達增加［23］。前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）與卵泡的生長發(fā)育密切相關(guān)，其表達的增加可以改善不良妊娠結(jié)局［24］。血管生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor-1，F(xiàn)LT1）是胎盤功能障礙的生物標志物，可用于識別IUGR等不良妊娠的發(fā)生［25］。螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶（conserved helix-loophelix ubiquitous kinase，CHUK）可影響NF-κB信號通路活性，從而參與IUGR病理過程［26］。趨化因子配體12（CXC chemokine ligand 12， CXCL12）是胎盤血管生成的關(guān)鍵驅(qū)動因素，在IUGR患者中表達水平升高［27］。原癌基因（FBJ osteosarcoma oncogene，F(xiàn)OS）可以影響胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖，在IUGR患者表達降低［28］，瘦素可以調(diào)節(jié)胎盤的細胞增殖、蛋白質(zhì)合成、侵襲和凋亡等過程，其表達的改變與流產(chǎn)、先兆子癇以及IUGR的發(fā)病息息相關(guān)［29］。轉(zhuǎn)錄因子RELB可以調(diào)節(jié)胎盤中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放和前列腺素的釋放，在妊娠中發(fā)揮重要作用［30］。趨化因子配體2（CXC chemokine ligand 2， CXCL2）在早產(chǎn)小鼠的胎盤中表達上升［31］。對10個關(guān)鍵基因進行ROC分析發(fā)現(xiàn)10個關(guān)鍵基因均有良好的診斷效果，進一步驗證了關(guān)鍵基因的準確性。

為深入探索免疫浸潤在IUGR發(fā)病中的作用，本研究利用ssGSEA算法對樣本進行分析。結(jié)果顯示，與正常的胎盤組織相比，IUGR胎盤組織中NKT細胞明顯增多，單核細胞在IUGR胎盤組織中減少。NKT細胞介導(dǎo)了胎兒母體免疫，在妊娠早期的Th1型應(yīng)答中起重要作用，NKT細胞的激活會導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)［32］。單核細胞能夠吞噬衰老、受傷的細胞和入侵人體內(nèi)部的異物，對人體免疫功能發(fā)揮重要作用。研究表明，淋巴細胞與單核細胞比例的增高提示不良妊娠的發(fā)生［33］。以上文獻研究提示本預(yù)測具有一定的參考意義。此外，本研究通過評估IUGR胎盤相關(guān)免疫細胞的浸潤情況及分析關(guān)鍵基因表達水平的高低與不同免疫細胞浸潤程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這7個關(guān)鍵基因的異常表達與免疫細胞的浸潤有一定相關(guān)性。

為了從眾多中藥中篩選治療IUGR的藥物，本文通過COREMINE數(shù)據(jù)庫對干預(yù)IUGR免疫浸潤的相關(guān)中藥進行預(yù)測并對其歸經(jīng)和功效分析，發(fā)現(xiàn)藥物多歸于肺經(jīng)、肝經(jīng)以及腎經(jīng)且藥物多為清熱類以及補虛類。根據(jù)預(yù)測結(jié)果選出出現(xiàn)頻數(shù)最高的中藥，并結(jié)合相關(guān)文獻研究，發(fā)現(xiàn)人參以及黃芩最有可能通過干預(yù)IUGR的免疫機制起到治療效果。人參味甘微溫，自古以來便有百草之王之稱。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可以增強機體的免疫功能［34］。臨床研究發(fā)現(xiàn)人參治療先兆流產(chǎn)的療效可靠，這與人參能提高機體免疫力以及抑制血清TNF-α的分泌等機制有關(guān)［35］。實驗研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉總皂苷可以通過抑制炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激改善IUGR大鼠的妊娠結(jié)局［36］。黃芩為性寒味苦，具有清熱安胎之功效，臨床常用黃芩來治療妊娠類疾病［37］。黃芩苷是黃芩的主要活性成分，具有抗炎和抗凋亡的功能，黃芩苷可有效減輕先兆子癇大鼠胎盤中的促炎細胞因子產(chǎn)生，抑制免疫反應(yīng)，改善妊娠結(jié)局［38］。黃芩苷還可提高IUGR胎鼠存活率，增加IUGR胎鼠體質(zhì)量［39］。以上文獻研究進一步證實人參以及黃芩最有可能通過干預(yù)機體免疫功能，作為IUGR分子治療藥物的潛在來源。

本文利用生物信息學(xué)方法對于IUGR的免疫浸潤機制進行分析，并預(yù)測免疫相關(guān)關(guān)鍵基因所涉及的中藥，對于IUGR的機制研究及臨床用藥具有參考意義。本研究局限之處在于數(shù)據(jù)分析來源依賴于GEO數(shù)據(jù)庫中的IUGR芯片，芯片納入的樣本數(shù)量有限，對于結(jié)果的分析可能造成偏差，因此需要進一步實驗驗證。