HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒誘導肝細胞表達Ⅰ型干擾素的研究

潘穎 楊凱 陳謹 孫蓓蓓 田平平 張發蘇 （.安徽醫學高等專科學校醫學技術學院，合肥 3060；.安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，合肥 3060）

Ⅰ型干擾素主要包括IFN-α和IFN-β，在病毒感染期間，宿主對病毒入侵的初始反應是誘導Ⅰ型干擾素產生并與其受體（interferon-α/β receptor，IFNAR）結合，激活酪氨酸蛋白激酶和信號轉錄與轉錄激活因子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號通路，合成多種抗病毒蛋白，如：核糖核酸依賴性蛋白激酶（protein kinase RNA dependent，PKR）、2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（2'-5'oligoadenylate synthetase，OAS）、黏病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance protein A，MxA），直接抑制病毒復制［1-2］。除了直接的抗病毒作用外，IFN-α還可以強烈調節宿主的先天性和適應性免疫反應［3-4］，如：增強NK細胞的增殖、CD8+T細胞和巨噬細胞的細胞毒性以及IFN-γ分泌等，以增強宿主對病原體的清除能力，因此，Ⅰ型干擾素信號通路激活是宿主早期重要的自然防御機制，在抑制病毒入侵方面發揮重要作用。然而，WIELAND等［5］對實驗室感染HBV的黑猩猩進行體內研究表明，HBV不能誘導干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的表達，所以可以在肝臟中持續復制；SUSLOV等［6］通肝臟活檢發現，HBV感染患者肝組織中IFN和ISG的表達被抑制，使得病毒不能被有效清除；本課題組亦在前期研究中發現，由HBV編碼的HBx蛋白可以抑制外源性Ⅰ型干擾素誘導抗病毒蛋白MxA的合成［7］。據此，本課題組推測HBV很有可能通過損傷Ⅰ型干擾素信號通路，影響機體的先天免疫應答，從而引起病毒感染的慢性化。為此，本課題組擬研究HBV對肝細胞中Ⅰ型干擾素表達的影響，并進一步探討可能存在的機制，為揭示HBV慢性感染與宿主免疫功能紊亂的關系提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2和HepG2.2.15細胞由安徽醫學高等專科學校生化實驗室保存；細胞培養基DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 3000TM轉染試劑盒、ECL超敏發光試劑盒購自美國Thermo公司；TRIzol購自美國Life technogies公司；氯仿、異丙醇及乙醇均為分析純；反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；熒光染料購自中國Novoprotein公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自碧云天試劑公司；mock-siRNA、HBxsiRNA及引物由上海生工生物合成；HBx、p-IRF3及GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；pEGFP-N1和pEGFP-HBx質粒由南京大學附屬鼓樓醫院劉巧玉博士惠贈；熒光顯微鏡購自德國Leica公司；熒光定量PCR儀購自美國Thermo Scientific公司；電泳儀、電泳槽購自上海天能科技有限公司；自動曝光儀購自培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 HepG2和HepG2.2.15細胞用含10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養，取對數生長期的細胞以2×105個/ml密度接種于6孔板用于轉染，待細胞融合度達到80%～90%時候，改用無胎牛血清DMEM培養，以Lipofectamine 3000TM轉染試劑將mock-siRNA和HBxsiRNA轉染至HepG2.2.15細胞，48 h后收集細胞沉淀檢測HBx蛋白表達水平；將帶綠色熒光蛋白的pEGFP-N1和pEGFP-HBx質粒轉染至HepG2細胞，在熒光顯微鏡下觀察HBx蛋白的表達。

1.2.2 熒光定量PCR檢測Ⅰ型干擾素IFN-α和IFN-β mRNA含量 收集轉染前后的細胞沉淀，加入1 ml TRIzol完全裂解，再加入0.2 ml氯仿振蕩離心取上清，加入0.5 ml預冷的異丙醇，-20 ℃孵育30 min后離心去上清，最后加入1 ml預冷的75%乙醇，12 000 r/min離心去上清，室溫干燥RNA沉淀，按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。以cDNA為熒光定量的模板，運用SYBR Green PCR試劑盒進行擴增反應，PCR儀設置擴增程序為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40個循環，72 ℃20 s。目的mRNA相對表達量的計算方法為2-ΔΔCt。所用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Western blot檢測HBx及p-IRF3蛋白含量使用RIPA細胞裂解液細胞，并以12 000 r/min離心10 min收集上清液，即含有細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入蛋白上樣緩沖液，經沸水浴加熱10 min以充分變性蛋白質，待樣品冷卻至室溫后，上樣至加樣孔內行SDSPAGE蛋白電泳1.5 h、轉膜、封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。采用ECL超敏發光試劑檢測目的蛋白。

1.3 統計學分析 采用MedCalc10.4軟件進行數據統計分析，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV對肝細胞中Ⅰ型干擾素表達的影響 熒光定量PCR分析顯示，與HepG2細胞相比，轉染HBV全基因組的HepG2.2.15細胞中IFN-α和IFN-β的mRNA水平升高，但差異不具有統計學意義（P＞0.05，圖1），提示HBV在體外細胞中并未充分誘導Ⅰ型干擾素的表達。

圖1 Ⅰ型干擾素在HepG2和HepG2.2.15細胞中的表達Fig.1 Expression of typeⅠinterferon in HepG2 and HepG2.2.15 cells

2.2 HBx-siRNA上調細胞中IFN-α和IFN-β mRNA含量 將mock-siRNA和HBx-siRNA分別轉染至HepG2.2.15細胞，結果顯示，與未經處理的HepG2.2.15細胞相比，轉染HBx-siRNA的細胞中HBx蛋白表達顯著降低（P＜0.01，圖2A），而IFN-α和IFN-β mRNA含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.001，圖2B），提示HBV可通過HBx抑制Ⅰ型干擾素信號通路激活。

圖2 HBx-siRNA對HepG2.2.15細胞內IFN-α和IFN-β表達的影響Fig.2 Effects of HBx-siRNA on expressions of IFN-α and IFN-β in HepG2.2.15 cells

2.3 pEGFP-HBx通過抑制IRF3的磷酸化影響Ⅰ型干擾素信號通路 將HepG2細胞分別轉染空載體質粒pEGFP-N1和pEGFP-HBx，48 h后運用熒光顯微鏡觀察HBx蛋白在細胞中的表達（圖3A）。進一步分析各轉染細胞中Ⅰ型干擾素mRNA及p-IRF3蛋白的表達，結果顯示，與空載體轉染的HepG2細胞相比，轉染pEGFP-HBx質粒的細胞中p-IRF3蛋白含量降低，IFN-α和IFN-β mRNA水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖3B、C）。

圖3 HBx蛋白影響HepG2細胞p-IRF3和Ⅰ型干擾素表達Fig.3 HBx protein affects expressions of p-IRF3 and typeⅠ interferon in HepG2 cells

3 討論

HBV是一種非細胞病變的嗜肝DNA病毒，可編碼多種病毒蛋白，如：DNA多聚酶、表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和HBx蛋白［8-9］。肝臟急性感染HBV后，90%～95%的患者能夠清除感染并完全康復，其余5%～10%的患者發展為慢性HBV感染，并且部分逐步發展為肝硬化和肝細胞癌［10］。WHO估計全世界約有2.57億人呈慢性HBV感染，每年有近100萬人死于HBV相關并發癥［11］。一般認為，HBV感染的結局取決于病毒與宿主免疫系統的相互作用，研究表明，HBV會抑制宿主的免疫系統，表現為先天和適應性免疫細胞功能障礙，而Ⅰ型干擾素在體內具有調節先天免疫反應和激活后天免疫反應的作用［12-13］。此外，盡管常規和聚乙二醇化的IFN-α蛋白已成為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的一線治療藥物，且Ⅰ型干擾素的抗病毒作用已明確，但在CHB患者中IFN-α治療的病毒清除率相當低，具體機制尚未明確［14-15］，因此推測HBV可能影響了Ⅰ型干擾素信號通路。為此，本實驗通過對比HepG2細胞和轉染HBV全基因組的HepG2.2.15細胞中IFN-α和IFN-β的基因表達量，證實HBV并不能充分誘導肝細胞表達Ⅰ型干擾素，進一步將HBx-siRNA轉染至HepG2.2.15細胞發現，抑制肝細胞在病毒轉錄中維持共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）微型染色體的重要調節蛋白—HBx蛋白的表達，可上調IFN-α和IFN-β的mRNA水平，提示HBx可能抑制了HBV誘導肝細胞表達Ⅰ型干擾素。

Ⅰ型干擾素的產生受到干擾素調節因子（interferon regulatory factors，IRFs）家族的調控，其中，IRF3是Ⅰ型干擾素信號通路的主要調節因子，機體感染病毒后，可通過模式識別受體對病毒病原體相關分子模式進行識別，導致下游轉錄因子IRF-3的激活和核轉位，從而誘導IFN-α和IFN-β的表達［16-17］。而在HBV持續感染的肝細胞中，模式識別受體及IRF3呈低表達，LEE等［18］通過將IRF3小分子激活劑處理HBV感染的細胞，發現激活IRF3可誘導先天免疫作用，抑制HBV cccDNA的形成。在本研究中，將HBV編碼的HBx基因表達質粒轉染至HepG2細胞，檢測結果顯示，過表達HBx蛋白的HepG2細胞中IFN-α和IFN-β mRNA表達水平均下降，且磷酸化的IRF3蛋白含量亦降低。

綜上所述，本研究通過對培養的肝細胞模型進行HBx基因過表達和沉默，揭示了HBV通過其所編碼表達的HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化，從而抑制Ⅰ型干擾素的表達，本實驗為進一步探討HBV感染的慢性化機制以及解決臨床CHB患者Ⅰ型干擾素治療應答不佳提供了新的思路。