利拉魯肽調控Nrf2/ARE介導的焦亡通路減輕2型糖尿病大鼠心肌損傷的機制研究

莊天微 帥天姣 郭長秀 謝偉 王彤彤 （.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院內分泌科，牡丹江 57000；.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院眼科，牡丹江 57000；.黑龍江省牡丹江林業中心醫院骨科，牡丹江 570）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的一種嚴重并發癥，是DM患者死亡的主要原因之一，其特點為心肌結構及功能障礙，而心肌細胞死亡是DCM的基本病理特征［1］。盡管現今已有多種藥物控制血糖及恢復心臟功能，但DCM的發病率和病死率仍在持續增長［2］。細胞焦亡是一種炎癥相關的細胞程序性死亡，參與DCM的發生發展［3］。有效抑制細胞焦亡對DCM患者的生存至關重要，因此迫切需要尋找相應的治療藥物。核因子E2相關轉錄因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）被證實參與調控抗氧化損傷，可與抗氧化反應原件（antioxidant response element，ARE）進一步結合，啟動血紅素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）表達，Nrf2/ARE對焦亡通路具有顯著的負調控作用［3-4］。利拉魯肽作為一種抗糖尿病藥物，可有效抑制胰高血糖素生成，改善胰島素分泌［5-6］。但目前關于利拉魯肽DM心肌焦亡方面的研究還較少，因此，本研究通過構建2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，探究利拉魯肽調控Nrf2/ARE通路對DM大鼠心肌細胞焦亡的影響，以期為利拉魯肽在DCM中的治療機制研究提供進一步參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60只SPF級SD大鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0010，于通風良好的環境中適應性飼養1周［室溫：（24±3） ℃，光照12 h/d］。

1.1.2 試劑及儀器 HE染色試劑盒、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（上海聯碩寶為生物科技有限公司）；Nrf2抑制劑ATRA（上海陶素生化科技有限公司）；利拉魯肽（Novo Nordisk A/S，國藥準字：J20160037，3 ml∶18 mg）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒、BCA試劑盒（北京孚博生物科技有限公司）；兔抗β-actin、HRP-IgG抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體（Abcam）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）抗體（Affinity Biosciences）；凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）（AdipoGen）；IL-18試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；IL-1β試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；兔抗IL-1β、IL-18抗體（Proteintech）；GelSMART凝膠成像儀［大龍興創實驗儀器（北京）有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 分組與T2DM模型構建 構建T2DM大鼠模型，采用高糖高脂飼料喂養大鼠8周后腹腔注射35 mg/kg STZ（溶于檸檬酸緩沖液），7 d后隨機進行3次尾靜脈取血檢測，血糖水平均＞11.1 mmol/L則為造模成功［7］；將造模成功的SD大鼠（10只/組，共50只）隨機分為T2DM組、低劑量組（35 μg/kg利拉魯肽）、中劑量組（70 μg/kg利拉魯肽）、高劑量組（140 μg/kg利拉魯肽）、高劑量+Nrf2抑制組（140 μg/kg利拉魯肽+Nrf2抑制劑ATRA 10 mg/kg）［8-9］；另取10只大鼠設為對照組，全程給予基礎飼料，注射等劑量檸檬酸緩沖液。低劑量組、中劑量組、高劑量組、高劑量+Nrf2抑制組大鼠分別腹腔注射相應劑量藥物，對照組及T2DM組注射等量生理鹽水（2次/d，12周）。

1.2.2 血糖水平檢測 實驗結束后，全部大鼠禁食12 h，取尾部靜脈血并用血糖儀紙片法檢測血糖水平。

1.2.3 ELISA檢測大鼠血清中IL-1β及IL-18水平

取各組大鼠腹主動脈血，3 000 r/min離心10 min，取上清，根據IL-1β及IL-18 ELISA試劑盒操作步驟測定血清中二者水平。

1.2.4 HE染色 各組隨機選取5只大鼠，取其心臟組織進行常規石蠟包埋并連續切片（4 μm），部分使用HE染色試劑盒染色后封片，顯微鏡觀察；另一部分進行TUNEL染色。

1.2.5 TUNEL染色 取石蠟切片，經烘干、PBS清洗后，置于TUNEL反應液中孵育1 h后滴加DAB顯色，蘇木精復染，脫水，封片，光鏡觀察并拍照（棕褐色即為陽性染色細胞），Image ProPlus 6.0系統細胞計數后計算凋亡指數（apoptotic index，AI）（%）=（凋亡細胞/總細胞）×100%。

1.2.6 Western blot檢測心肌中焦亡相關蛋白表達 取各組剩余的5只大鼠，心臟組織于裂解液中研磨，12 000 r/min離心10 min，取上清后BCA法測定蛋白含量，取蛋白樣品并混入上樣緩沖液（4∶1），變性（100 ℃），加至已配制好的分離膠中（30 μg/孔）進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗（兔抗β-actin、Caspase-1、ASC、Nrf2、HO-1、IL-1β、IL-18抗體，1∶1 000）孵育過夜后，于次日依次進行TBST洗滌及二抗孵育（2 h），ECL顯影后，于蛋白凝膠成像儀中觀察，Image J分析各條帶灰度值，并計算其含量（β-actin為內參，n=5）。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0分析處理計量資料，并用±s描述，多組間比較行One-Way ANOVA分析，組間比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖水平比較 相較于對照組，T2DM組大鼠空腹血糖水平顯著升高（P＜0.05）；相較于T2DM組，低劑量組空腹血糖水平差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量組空腹血糖水平依次顯著降低（P＜0.05）；相較于高劑量組，高劑量+Nrf2抑制組空腹血糖水平顯著提高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血糖及炎癥因子水平比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of blood glucose and inflammatory factors levels of rats in each group （±s，n=10）

表1 各組大鼠血糖及炎癥因子水平比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of blood glucose and inflammatory factors levels of rats in each group （±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition Fasting blood glucose/（mmol·L-1）5.70±1.01 26.84±3.051）25.05±3.84 16.84±2.182）3）8.50±1.032）3）4）IL-18/（pg·ml-1）20.14±2.11 69.01±5.391）65.95±6.80 48.69±4.082）3）31.46±4.362）3）4）IL-1β/（pg·ml-1）18.05±2.54 53.61±4.931）50.04±5.76 45.18±4.332）3）29.10±3.222）3）4）15.05±2.955）46.92±5.225）43.81±4.165）

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較 相較于對照組，T2DM組大鼠血清IL-18及IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；相較于T2DM組，中、高劑量組IL-18及IL-1β水平依次顯著降低（P＜0.05）；相較于高劑量組，高劑量+Nrf2抑制組IL-18及IL-1β水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

2.3 大鼠心肌組織病理學情況觀察 對照組大鼠心肌細胞結構清晰、完整，排列有序，未發生炎癥細胞浸潤現象；相較于對照組，T2DM組心肌細胞肥大、排列紊亂、肌纖維結構模糊不清，發生炎癥細胞浸潤現象；相較于T2DM組，低劑量、中劑量組、高劑量組心肌肥大及炎癥細胞浸潤現象減輕，心肌細胞結構較為完整，排列逐漸有序；相較于高劑量組，高劑量+Nrf2抑制組上述心肌損傷現象加重。見圖1。

圖1 心肌組織病理學情況觀察（HE，×200）Fig.1 Observation of myocardial histopathology （HE，×200）

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡水平比較 相較于對照組，T2DM組大鼠心肌細胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05）；相較于T2DM組，中、高劑量組細胞凋亡水平依次顯著降低（P＜0.05）；相較于高劑量組，高劑量+Nrf2抑制組細胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡水平比較（×400）Fig.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （×400）

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （±s，n=5）

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡水平比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of apoptosis levels of rat cardiomyocytes in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

AI/%3.07±0.27 37.20±10.391）34.80±7.21 22.47±4.092）3）10.03±2.232）3）4）23.27±3.665）Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition

2.5 各組大鼠心肌焦亡相關蛋白表達比較 相較于對照組，T2DM組大鼠心肌組織中焦亡相關蛋白Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表達水平升高，Nrf2、HO-1表達水平降低（P＜0.05）；相較于T2DM組，中、高劑量組Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表達水平降低，Nrf2、HO-1表達水平升高（P＜0.05）；相較于高劑量組，高劑量+Nrf2抑制組Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18表達水平均升高，Nrf2、HO-1表達水平降低（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 各組大鼠心肌焦亡相關蛋白表達比較Fig.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group

表3 各組大鼠心肌焦亡相關蛋白表達比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group （±s，n=5）

表3 各組大鼠心肌焦亡相關蛋白表達比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of expressions of myocardial pyroptosis-associated proteins of rats in each group （±s，n=5）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with T2DM group，2）P＜0.05；compared with low dose group，3）P＜0.05；compared with medium dose group，4）P＜0.05；compared with high dose group，5）P＜0.05.

Groups Control T2DM Low dose Medium dose High dose High dose+Nrf2 inhibition Nrf2/β-actin 1.08±0.07 0.17±0.031）0.16±0.03 0.42±0.092）3）0.86±0.062）3）4）0.38±0.085）HO-1/β-actin 1.51±0.14 0.24±0.081）0.22±0.07 0.58±0.092）3）1.21±0.122）3）4）0.59±0.115）ASC/β-actin 0.51±0.08 1.34±0.211）1.30±0.20 0.86±0.132）3）0.64±0.072）3）4）0.85±0.105）Caspase-1/β-actin IL-1β/β-actin IL-18/β-actin 0.71±0.06 1.83±0.251）1.80±0.23 1.26±0.132）3）0.81±0.142）3）4）1.28±0.165）0.62±0.10 1.43±0.201）1.40±0.23 0.99±0.142）3）0.73±0.082）3）4）1.01±0.135）0.30±0.05 1.52±0.231）1.49±0.20 1.10±0.112）3）0.60±0.082）3）4）1.12±0.155）

3 討論

DM是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，DM患者患心血管疾病的風險較正常人高2～4倍，DCM是DM的常見并發癥，也是造成DM患者死亡的主要原因［10］。心肌細胞丟失導致的心功能受損是DCM的基本病理特征。細胞焦亡是有別于細胞凋亡、壞死的促炎程序性細胞死亡，越來越多的研究表明，心肌細胞焦亡會造成DCM的發生，因此，有效抑制心肌細胞焦亡對DCM的治療極其重要［11］。

利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，其降血糖功效已得到證實，而近幾年，大量臨床試驗發現，其可降低不良心臟事件的發生風險［12-13］。利拉魯肽可改善T2DM患者的血糖水平，并減輕患者體重，可用于代謝相關疾病手術后復發或持續的T2DM患者輔助治療［14］。利拉魯肽可控制糖尿病小鼠血糖水平，能夠通過增加TGF-β1、PPARγ表達抑制心肌細胞凋亡，改善心肌損傷［15］。利拉魯肽能夠通過調控焦亡參與改善高糖高脂，降低胰島功能損傷程度［16］。本研究發現，利拉魯肽能夠有效降低T2DM大鼠空腹血糖、心肌組織病理學程度、心肌細胞凋亡水平，與既往研究結果相似，該結果表明，利拉魯肽具有降血糖，改善T2DM大鼠心肌損傷作用，提示利拉魯肽有作為DCM潛在治療藥物的潛能［15］。

細胞焦亡是由炎癥小體誘導的一種細胞死亡機制，可受多種調控因子影響，銜接蛋白ASC作為焦亡反應主要復合物，是NLRP3炎癥體的主要組成，ASC的CARD和Caspase-1的CARD結合可形成NLRP3炎性體并激活Caspase-1，Caspase-1可促進IL-1β成熟并活化，誘導IL-18等炎癥因子合成，擴大炎癥反應，從而引發細胞焦亡［11，17］。大量研究發現，caspase-1活化促進DCM大鼠心肌細胞焦亡，IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表達水平是評估焦亡水平的重要標志［18］。近來有研究指出，Nrf2/ARE廣泛參與調控焦亡通路，抑制細胞焦亡的同時改善組織發育［19］。有研究發現，利拉魯肽能夠通過促進Nrf2/ARE通路蛋白表達，減少氧化產物生成，保護DM引發的腦缺血損傷［20］。本研究發現，中、高劑量利拉魯肽處理均可顯著降低T2DM大鼠IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表達，上調Nrf2、HO-1表達水平，低劑量利拉魯肽無顯著變化，推測達到一定劑量的利拉魯肽很可能通過調控Nrf2/ARE介導的焦亡通路發揮作用。為進一步證實該推論，本研究在利拉魯肽處理的同時抑制Nrf2表達，發現抑制Nrf2能夠顯著增加大鼠IL-18、IL-1β、Caspase-1、ASC表達，降低Nrf2、HO-1表達水平，促進細胞焦亡，逆轉利拉魯肽對T2DM大鼠心肌損傷的改善作用，證實利拉魯肽通過調控Nrf2/ARE介導的焦亡通路，減輕T2DM大鼠心肌細胞焦亡，改善心肌損傷。

綜上所示，利拉魯肽通過調控Nrf2/ARE介導的焦亡通路，促進Nrf2/ARE通路蛋白表達，抑制細胞焦亡，改善心肌損傷，利拉魯肽可能成為DCM的有效治療藥物。本研究不僅對DCM的治療機制研究具有重要價值，還為DCM新型治療藥物的尋找提供參考，是否有其他通路間接參與調控還需深入探討，后續課題組將對此進行專項研究。