黃芪甲苷通過調控Caspase-1介導的經典焦亡途徑抑制細胞焦亡緩解腦缺血/再灌注損傷的研究

張怡 侯仙明 張拴成 周曉紅 劉璐瑤 王澤超 高維娟

（河北中醫藥大學，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，石家莊 050091）

腦卒中是世界范圍內引發人類死亡和殘疾的常見病。近年來，盡管腦卒中的發病率有所下降，但其相關病死率在發達國家和發展中國家都居高不下［1］。流行病學調查顯示腦卒中已經成為全球第二位、我國首位致死原因，其中缺血性腦卒中占比較大，約占全部腦血管病的87%［2-3］。腦組織極易受缺血影響，腦血流完全中斷5 min后就會觸發神經元大量死亡，因此亟需通過血流的再通恢復腦組織氧氣和營養的供應，但血流恢復后，有時也會由于自由基的過量產生和炎癥細胞的異常募集等造成腦組織二次損傷，即腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。最新研究發現，細胞焦亡在腦I/R損傷中具有重要作用，是干預腦I/R損傷的最新靶點［4］。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ）從中藥黃芪中提取，是黃芪的主要活性成分之一。大量研究表明，黃芪甲苷可有效緩解包括腦I/R損傷在內的多種中樞神經系統疾病［5］。課題組前期研究證實，黃芪甲苷可通過調控細胞自噬和凋亡緩解腦I/R損傷［6］，但其對I/R損傷后神經細胞焦亡的作用及具體機制鮮有報道。因此，依托前期基礎，本實驗通過大鼠大腦中動脈阻塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型研究黃芪甲苷對Caspase-1經典焦亡信號通路的影響，從抑制細胞焦亡角度，探討其緩解腦I/R損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質量240～280 g，8～10周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證：SCXK（京）2016-0011。本研究經河北中醫學院實驗動物管理和倫理委員會審核（編號：DWLL202203020），受試動物實驗過程符合醫學倫理要求。

1.1.2 實驗藥物及主要試劑 黃芪甲苷，規格：20 mg，純度＞98%，購于上海源葉生物科技有限公司。TTC染色液（2%）由北京索萊寶科技有限公司提供；NLRP3單克隆抗體（ab270449）、IL-18單克隆抗體（ab207323）均購于Abcam公司；IL-1β多克隆抗體（A11369）由Abclonal公司提供；Cleaved Caspase-1多克隆抗體（AF4005）購自Affinity公司；HE染色試劑盒、小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、TUNEL試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 多功能小動物手術臺購自Kent公司；體式顯微鏡（SMZ745）購自NIKON公司；組織包埋機（EG11508）、全自動輪轉切片機（RM2265）、熒光顯微鏡（DM5000B）均為Leica公司產品；雙色紅外激光成像系統（Odyssey clx）購自Licor公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與給藥方法 根據實驗需求將SD大鼠隨機分為4組：假手術組（Sham）、模型組（MCAO/R）、溶劑對照組（DMSO）和黃芪甲苷組（AS-Ⅳ）（20 mg/kg）。大鼠腦I/R損傷模型按照如下方法制備：戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉提前禁食禁水的大鼠，麻醉后的大鼠采用仰臥位固定于小動物手術臺上，并將體溫保持在（37±0.5） ℃。將大鼠沿頸部中線切開皮膚，小心分離頸外動脈，然后將線栓從頸外動脈插入頸內動脈并抵達大腦中動脈的起點，從而閉塞大腦中動脈，實現腦組織缺血［7］。阻塞大腦中動脈2 h后，拔出線栓恢復腦血流，完成大鼠腦組織I/R。假手術組大鼠除不進行插線外，其他步驟與模型組相同。黃芪甲苷溶于DMSO中，于再灌注的同時腹腔注射給藥，藥物濃度為20 mg/kg［8］。

1.2.2 Zea Longa神經功能學評分 在大鼠手術蘇醒后和腦I/R 24 h，由對實驗分組不明的研究人員對大鼠進行Zea Longa神經功能學評分，評估大鼠的神經功能缺陷［9］。

1.2.3 TTC染色 I/R 24 h后，每組隨機選擇3只大鼠，麻醉后斷頭取腦，腦組織置于-20 ℃冰箱冷凍10 min后，分解為2 mm厚的冠狀切片，37 ℃下采用2%TTC染液對腦組織切片進行染色，終止染色后使用相機對腦組織切片進行拍照。其中白色區域為梗死區，紅色區域表示正常組織。

1.2.4 HE染色 腦組織石蠟切片脫蠟至水后，按試劑盒說明進行HE染色，鏡下觀察腦組織病理損傷并進行拍照。

1.2.5 Caspase-1和TUNEL免疫熒光雙染色 將腦組織石蠟切片脫蠟至水，滴加Proteinase K工作液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；按照Recombinant TdT enzyme∶FITC-12-dUTP Labeling Mix∶Equilibration Buffer=1 μl∶5 μl∶50 μl（1∶5∶50）比例配制TdT孵育緩沖液；滴加50 μl TdT孵育緩沖液，孵育Caspase-1一抗（1∶50），4 ℃過夜，孵育二抗，DAPI工作液37 ℃染核，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照，Caspase-1呈紅色熒光，TUNEL呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。陽性細胞為3色重疊細胞，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對細胞進行分析。

1.2.6 Western blot測定腦組織焦亡通路相關蛋白表達 分離缺血側腦組織并勻漿，12 000 r/min、4 ℃離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白經電泳、轉膜、封閉后，滴加NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-18及IL-1β抗體，稀釋濃度均為1∶1 000， 4 ℃冰箱內孵育過夜。二抗稀釋濃度為1∶3 000，搖床輕搖，室溫孵育1 h，化學發光法顯影條帶，條帶分析應用Image J軟件進行。

1.3 統計學處理 應用GraphPad Prism 8軟件對數據結果進行統計學分析。實驗數據采用xˉ±s表示，不同實驗組間的比較應用單因素方差分析和多重比較的dunnett′s方法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷顯著改善MCAO/R大鼠神經功能缺損 如圖1所示，腦I/R 24 h導致大鼠神經功能學評分顯著升高，出現嚴重神經功能缺損情況（P＜0.01）；黃芪甲苷治療后，大鼠神經缺損情況明顯緩解，神經功能學評分顯著降低（P＜0.01）；溶劑對照組大鼠神經功能學評分與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦I/R 24 h神經功能缺損情況Fig.1 Neurological deficit of rats at 24 h after I/R in each group

2.2 黃芪甲苷有效縮小MCAO/R大鼠腦梗死體積 如圖2所示，假手術組大鼠腦組織全域紅染，無明顯梗死灶；與假手術組比較，模型組大鼠腦組織出現大范圍白色梗死區域（P＜0.01）；黃芪甲苷治療后，大鼠腦梗死體積同模型組相比顯著縮小（P＜0.01）；溶劑對照組大鼠腦梗死體積與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腦I/R 24 h腦組織梗死體積Fig.2 Infarct volume of rats measured at 24 h after cerebral I/R in each group

2.3 黃芪甲苷顯著緩解MCAO/R大鼠腦組織病理損傷 如圖3所示，假手術組大鼠腦組織細胞數量豐富且形態正常；模型組及溶劑對照組大鼠腦組織細胞數量明顯減少，部分細胞核濃縮、染色變深，或見細胞核溶解、消失，細胞體變小，排列紊亂，部分壞死細胞溶解消失（黑色箭頭所示）；黃芪甲苷治療后，大鼠腦組織病理損傷顯著緩解，細胞數量相對豐富，細胞水腫、胞質呈空泡狀（黑色箭頭所示）。

圖3 各組大鼠腦組織形態（×200）Fig.3 Morphology of brain tissue of rats in each group（×200）

2.4 黃芪甲苷有效減輕MCAO/R大鼠腦組織細胞焦亡 如圖4所示，假手術組腦組織可見個別紅、綠、藍三色重疊細胞；與假手術組比較，模型組大鼠腦組織三色重疊細胞（綠色箭頭所示）明顯增多，細胞焦亡顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦組織陽性細胞（綠色箭頭所示）顯著減少，細胞焦亡有所緩解（P＜0.01）；溶劑對照組大鼠腦組織焦亡細胞數與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 黃芪甲苷顯著降低MCAO/R大鼠腦組織經典焦亡途徑相關蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18表達 如圖5所示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達顯著降低（P＜0.01），溶劑對照組各蛋白表達與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達Fig.5 Expressions of NLRP3， Cleaved Caspase-1，IL-1β and IL-18 in brain tissue of rats in each group

3 討論

I/R損傷是缺血性腦卒中通過溶栓或手術恢復血流供應后的常見并發癥，可引發一系列有害的細胞反應，最終通過細胞死亡導致腦功能衰竭［10］。最新研究發現，細胞焦亡是腦I/R損傷的重要病理生理過程，可引發炎癥反應，導致神經細胞損傷或死亡，調控細胞焦亡成為干預腦I/R損傷的最新靶點［11］。

細胞焦亡是一類程序性、溶解性細胞死亡方式，以質膜快速破裂，隨后釋放細胞內容物和促炎介質為特征，其中經典焦亡途徑依賴于Caspase-1介導［12］。大量研究顯示，Caspase-1介導的經典焦亡途徑參與了腦I/R后神經元損傷，阻斷Caspase-1表達能顯著緩解I/R后腦組織損傷［13］。Caspase-1的激活由一系列能形成炎性小體的模式識別受體觸發。NLRP3是中樞神經系統中最豐富的炎性小體，由NLRP3、ASC和Caspase-1組成［14］。腦I/R損傷發生后，受損腦組織細胞線粒體迅速產生活性氧，并啟動氧化應激等程序［15］。活性氧可促進NLRP3、ASC、pro Caspase-1寡聚，進而激活NLRP3炎性小體。活化的NLRP3炎性小體促進pro Caspase-1自切割為成熟的Caspase-1。成熟的Caspase-1具有兩種功能：①切割GSDMD并產生GSDMD-NT片段，GSDMD-NT片段可與質膜中的磷酸肌醇結合，在細胞膜形成寡聚孔，導致細胞發生焦亡；②催化pro-IL-18和pro-IL-1β成熟為IL-18和IL-1β，它們被釋放到細胞外基質，引起炎癥反應［16］。因此，尋找能夠安全有效緩解細胞焦亡、抑制炎癥反應的神經保護劑成為神經科學界亟待解決的問題。本研究顯示，大鼠腦I/R后，神經功能嚴重缺損，腦組織大范圍梗死，神經細胞焦亡顯著，NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達明顯升高，Caspase-1介導的經典焦亡通路被激活。

大量研究發現，許多中藥具有良好的神經保護作用。其中黃芪為諸多醫家治療腦卒中的首選藥。名醫王肯堂曾提出：“卒仆、偏枯之癥，雖有多因……黃芪為必用之君藥”。黃芪，出自《神農本草經》，從古至今被廣泛應用于腦卒中的臨床治療，其具有皂苷、多糖等200多種化學成分，其中黃芪甲苷為黃芪的質控標志物。黃芪甲苷是提取自黃芪的純化小分子皂苷，藥理學研究證實，黃芪甲苷具有調節能量代謝、抗炎、抑制氧化應激和控制細胞凋亡等作用，是具有良好應用前景的神經保護劑［17-18］。過去幾十年，許多不同臨床前研究在動物模型中證實了黃芪甲苷對局灶性腦I/R損傷的干預作用。本研究發現，黃芪甲苷能夠有效減輕大鼠因腦I/R造成的神經功能缺損癥狀，顯著緩解腦組織梗死，改善腦組織神經細胞壞死、丟失情況。本研究進一步探求其具體作用機制發現，黃芪甲苷能夠顯著降低Caspase-1與TUNEL共表達細胞數，緩解細胞焦亡；降低大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β和IL-18等經典焦亡通路蛋白表達。

綜上所述，黃芪甲苷可能通過調控Caspase-1介導的經典焦亡途徑抑制細胞焦亡，對I/R損傷后腦組織發揮神經保護作用（圖6）。但細胞焦亡途徑眾多，黃芪甲苷是否可通過其他焦亡途徑發揮抗腦I/R損傷的作用，仍待進一步探索。

圖6 黃芪甲苷緩解腦I/R損傷的作用機制Fig.6 Mechanisms of astragaloside Ⅳ alleviating cerebral I/R injury