木犀草素通過TLR4/PI3K/AKT通路對子癇前期大鼠胎盤血管生成及細(xì)胞凋亡的影響

曾克非 夏婷婷 吳小蘭 雷祥華

（1.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 吉安 343000；2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，吉安 343000）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種妊娠期特有的疾病，以蛋白尿和高血壓為主要表現(xiàn)，可導(dǎo)致胎盤持續(xù)性缺氧缺血，進(jìn)而引發(fā)炎癥，造成胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡及血管生成受損，影響胎兒器官發(fā)育，并損害母體健康，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一［1-2］。在PE發(fā)病過程中，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致胎盤功能受損的主要病理基礎(chǔ)，抗炎治療是改善PE患者臨床癥狀的有效策略［3-4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號分子，下調(diào)TLR4表達(dá)可抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路蛋白磷酸化，抑制小鼠促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，保護(hù)關(guān)節(jié)及肝組織免于炎癥損傷［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4還可通過抑制PE大鼠炎癥因子表達(dá)而恢復(fù)其螺旋動(dòng)脈重塑，促使胎兒生長［7］，而侯敬等［8］研究顯示PI3K/AKT信號在PE發(fā)病過程中具有重要作用，其通路蛋白在早發(fā)型PE患者體內(nèi)表達(dá)明顯升高，由此可知，下調(diào)TLR4/PI3K/AKT信號激活可能是防治PE的分子作用機(jī)制之一。木犀草素最初提取自木犀草莖、枝、葉中，是一種具有明顯抗炎功效的天然化合物，可通過下調(diào)TLR4/NF-κB通路表達(dá)改善變應(yīng)性鼻炎大鼠Th1/Th2失衡，減輕鼻黏膜炎癥損傷［9］。有研究顯示，木犀草素是銀杏葉的主要活性成分，可治療高血壓［10］。但木犀草素是否能夠通過TLR4/PI3K/AKT通路降低血壓，改善PE引發(fā)的胎盤血管生成受損及細(xì)胞凋亡還不清楚，本研究通過建立PE大鼠模型對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購自上海昇敞生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2021-0002，雌性（76只）體質(zhì)量180～210 g，雄性（38只）體質(zhì)量270～310 g，SPF級，在井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物中心適應(yīng)飼養(yǎng)1周，4～6只/籠，明暗各12 h交替照明，動(dòng)物房溫度、濕度分別為22～25 ℃、50%～60%，通風(fēng)換氣10～20次/h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批［倫批2023第（81）號］。

1.1.2 主要試劑與儀器 N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，F(xiàn)T011014）購于上海梵態(tài)生物科技有限公司；腺病毒包裝的TLR4過表達(dá)載體（含有空載對照）購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；大鼠IL-6 ELISA試劑盒、木犀草素（HPLC純度≥98%）、大鼠IL-17 ELISA試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司（貨號SEKR-0005、SL8300、SEKR-0007）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒、BCA法總蛋白定量測定試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試盒、高強(qiáng)度RIPA裂解液購于南京建成生物工程研究所（貨號：G001-1-1、A045-3-2、H052、W062-1-1）；大鼠二步法免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋公司（貨號ZLI-9017）；羊抗兔二抗、兔源Anti-BCL2相關(guān)X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）一抗、兔源Anti-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）一抗、兔源Anti-B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）一抗、兔源Anti-CD31一抗、兔源Anti-GAPDH一抗、兔源Anti-TLR4一抗、兔源Anti-PI3K一抗、兔源Antip-PI3K一抗、兔源Anti-p-AKT一抗、兔源Anti-AKT一抗購于美國Abcam公司（貨號ab150077、ab32503、ab184787、ab196495、ab281583、ab181602、ab13867、ab133595、ab182651、ab38449、ab179463等）。

血壓測量儀購于中國成都泰盟科技有限公司（型號：BL-410）；全自動(dòng)生化分析儀購于美國Beckman Coulter公司（型號：AU2700）；酶標(biāo)儀購于美國Bio Tek公司（型號：Synergy H4）；石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)購于德國MEDITE公司（型號TES99、BM2135）；倒置顯微鏡購于德國Leica公司（型號：DMIL/DFC295）；蛋白電泳儀購于美國Hoefer公司（型號：SE300）；轉(zhuǎn)印電泳儀購于中國北京六一生物科技有限公司（型號：DYCZ-40D）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司（型號：Transilluminator）。

1.2 方法

1.2.1 建立PE大鼠模型及分組給藥 將大鼠以2∶1的雌雄比例合籠，交配后獲得孕鼠72只（觀察到陰栓），隨機(jī)平分為6組：對照組、模型組、木犀草素組、TLR4過表達(dá)載體組、TLR4空載組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組，以陰栓脫落作為孕1 d，除對照組外，其余各組大鼠于孕10 d向其臀部皮下注射L-NAME，劑量為100 mg/kg［11］，對照組大鼠同時(shí)皮下注射等劑量0.9%NaCl溶液，所有大鼠均每天注射1次，持續(xù)至孕18 d，大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量顯著升高，表明PE模型制備成功。

將木犀草素溶于0.9%NaCl溶液中，制成4 mg/ml的藥液［12］，木犀草素組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組大鼠以10 ml/kg的劑量灌胃給藥，每日1次；TLR4過表達(dá)載體組、TLR4空載組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組大鼠靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的載體（TLR4過表達(dá)載體、空載對照濃度按照說明書設(shè)置）［13］，每周1次，對照組和模型組大鼠以10 ml/kg劑量每日灌胃給藥木犀草素1次，同時(shí)每周靜脈注射0.5 ml 0.9%NaCl溶液1次，各組大鼠均于孕13 d給藥，共給藥1周。

1.2.2 測定大鼠妊娠晚期24 h尿蛋白含量及平均動(dòng)脈壓 使用代謝籠收集孕20 d大鼠24 h內(nèi)的尿液，以生化分析儀測出其中尿蛋白含量；采用血壓測量儀測定孕20 d大鼠尾根部的收縮壓和舒張壓，計(jì)算平均動(dòng)脈壓=（收縮壓+舒張壓×2）/3。

1.2.3 檢測大鼠妊娠結(jié)局狀況及收集標(biāo)本 以乙醚麻醉孕21 d大鼠，采集尾靜脈血1.3 ml靜置離心，于-80 ℃冰箱中保存上清備用；然后打開子宮，取出胎鼠和胎盤，測量胎鼠體質(zhì)量并計(jì)數(shù)，獲得平均子代體質(zhì)量和平均子代數(shù)目；以手術(shù)剪取0.4 g胎盤組織，加入裂解液剪碎、勻漿、離心，以BCA法測出上清中總蛋白濃度后將其調(diào)至各組相等，最后分組標(biāo)記，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫皇Ｓ嗵ケP組織清洗、固定、脫水后，以儀器進(jìn)行包埋、切片備用。

1.2.4 測定大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平 提前取出1.2.3中的血清，以冰水浴慢慢解凍，采用試劑盒測定其中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 檢測大鼠胎盤組織血管生成及細(xì)胞凋亡狀況 取出1.2.3中的胎盤組織切片，每只大鼠選3張于37.5 ℃下脫蠟（二甲苯孵育15 min）、水化（100%～70%乙醇依次孵育10 min）、封閉（5%牛血清白蛋白孵育3 h）后，4 ℃孵育CD31一抗（稀釋比例1∶250）過夜，洗滌，37.5 ℃孵育二抗（稀釋比例1∶500） 3 h，使用試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，再次洗滌、脫水后透明、封片，任選鏡下5個(gè)視野拍照，以顯微鏡所帶有的病理分析軟件分析計(jì)算出CD31陽性細(xì)胞比例；每只大鼠再次選出3張切片，以上述相同方法脫蠟、水化后，TUNEL染色、洗滌、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照，同樣以病理分析軟件分析計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

1.2.6 大鼠胎盤組織TLR4/PI3K/AKT通路蛋白水平檢測 取出1.2.3中的胎盤組織蛋白樣品液，以冰水浴慢慢解凍，各組均取20 μg蛋白100 ℃煮沸5 min變性，上樣電泳后濕轉(zhuǎn)，均于120 V電壓下進(jìn)行80 min，然后將分離轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白于37.5 ℃封閉（3%牛血清白蛋白孵育2 h），然后4 ℃分別孵育一抗（Anti-GAPDH、Anti-TLR4、Anti-PI3K、Anti-p-PI3K、Anti-p-AKT、Anti-AKT、Anti-Bax、Anti-caspase-3、Anti-Bcl-2）過夜稀釋比例分別為1∶2 000、1∶3 000、1∶2 500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶1 500、1∶1 000，以TBST洗膜（3次，6 min/次）后37.5 ℃孵育二抗（稀釋比例1∶1 000） 2 h，再次以TBST洗膜（3次，6 min/次）后，以化學(xué)發(fā)光法使蛋白條帶顯色，拍照，以Image J軟件定量條帶灰度值，對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得到各蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)；組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩之間進(jìn)一步比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量均顯著降低（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量（±s，n=12）Tab.1 Average arterial pressure in third trimester of pregnancy and 24-hour urinary protein content of rats in each group （±s，n=12）

表1 各組大鼠妊娠晚期平均動(dòng)脈壓與24 h尿蛋白含量（±s，n=12）Tab.1 Average arterial pressure in third trimester of pregnancy and 24-hour urinary protein content of rats in each group （±s，n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Groups Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector Mean arterial pressure/mmHg 83.57±4.62 123.18±6.131）84.92±5.402）3）159.43±7.362）3）123.39±6.48 24 h urinary protein content/mg 6.13±1.12 11.65±1.671）6.48±1.182）3）16.23±2.092）3）11.69±1.58 121.94±9.41 11.22±1.43 71.593 0.000 F P 213.541 0.000

2.2 各組大鼠妊娠結(jié)局情況檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量（±s，n=12）Tab.2 Average offspring number and average offspring weight of rats in each group （±s， n=12）

表2 各組大鼠平均子代數(shù)目及平均子代體質(zhì)量（±s，n=12）Tab.2 Average offspring number and average offspring weight of rats in each group （±s， n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Groups Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector Average subalgebra/only 13.26±1.83 9.25±0.921）12.89±1.472）3）5.47±0.412）3）9.19±0.85 Average offspring weight/g 4.92±0.37 3.39±0.141）4.71±0.352）3）2.85±0.192）3）3.35±0.16 9.30±0.76 3.52±0.18 132.514 0.000 F P 75.716 0.000

2.3 各組大鼠胎盤微血管密度測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 免疫組化學(xué)染色檢測胎盤組織CD31表達(dá)（微血管密度）（×100）Fig.1 Expression of CD31 （microvessel density） in placental tissue detected by immunohistochemical staining （×100）

表3 各組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of CD31 positive cells in placental tissue of rats in each group （±s，n=12）

表3 各組大鼠胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of CD31 positive cells in placental tissue of rats in each group （±s，n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Proportion of CD31 positive cells/%Groups 32.25±4.15 11.64±0.921）31.14±5.132）3）4.05±0.342）3）11.59±0.87 11.71±1.05 213.127 0.000 Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector F P

2.4 各組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例顯著升高（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例均顯著降低（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

圖2 TUNEL染色檢測大鼠胎盤細(xì)胞凋亡情況（×200）Fig.2 Apoptosis of rat placental cells detected by TUNEL staining （×200）

表4 各組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例（±s，n=12）Tab.4 Proportion of placental cell apoptosis of rats in each group （±s，n=12）

表4 各組大鼠胎盤細(xì)胞凋亡比例（±s，n=12）Tab.4 Proportion of placental cell apoptosis of rats in each group （±s，n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Apoptosis/%3.83±0.54 32.67±5.281）4.23±0.632）3）54.89±6.492）3）33.25±6.02 31.91±6.15 191.826 0.000 Groups Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector F P

2.5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平均顯著降低（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠血

清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平（±s，n=12）Tab.5 Serum inflammatory factors IL-6， TNF-α and IL-17 levels of rats in each group （±s，n=12）

表5 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平（±s，n=12）Tab.5 Serum inflammatory factors IL-6， TNF-α and IL-17 levels of rats in each group （±s，n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Groups Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector IL-17/（pg·ml-1）45.93±1.61 184.27±8.251）48.14±2.082）3）276.42±13.012）3）186.06±9.73 180.58±9.64 1351.209 0.000 F P IL-6/（ng·L-1）47.25±6.13 110.48±12.691）50.13±6.842）3）164.05±16.202）3）112.57±13.02 108.19±14.31 158.309 0.000 TNF-α/（ng·L-1）129.53±9.75 213.48±17.511）131.97±10.362）3）292.86±26.182）3）214.39±18.73 210.85±20.12 138.207 0.000

2.6 各組大鼠胎盤組織凋亡相關(guān)蛋白及TLR4/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠胎盤組織凋亡蛋白Bax、caspase-3及TLR4/PI3K/AKT通路蛋白TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組、木犀草素+TLR4過表達(dá)載體組分別相比，木犀草素組大鼠胎盤組織凋亡蛋白Bax、caspase-3及TLR4/PI3K/AKT通路蛋白TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；TLR4過表達(dá)載體組大鼠胎盤組織凋亡蛋白Bax、caspase-3及TLR4/PI3K/AKT通路蛋白TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)水平均升高（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。與模型組相比，TLR4空載組大鼠胎盤組織上述各蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6、圖3。

圖3 Western blot檢測各組大鼠胎盤組織TLR4/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of TLR4/PI3K/AKT pathway protein in placental tissue of rats in each group was detected by Western blot

表6 各組大鼠胎盤組織TLR4/PI3K/AKT通路蛋白相對表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of TLR4/PI3K/Akt pathway protein in placenta of rats in each group （±s，n=12）

表6 各組大鼠胎盤組織TLR4/PI3K/AKT通路蛋白相對表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of TLR4/PI3K/Akt pathway protein in placenta of rats in each group （±s，n=12）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group； 3）P＜0.05 vs luteolin+TLR4 overexpression vector group.

Groups Control Model Luteolin TLR4 overexpression vector TLR4 empty Luteolin+TLR4 overexpression vector caspase-3/GAPDH Bcl-2/GAPDH 0.85±0.12 0.49±0.051）0.79±0.132）3）0.09±0.022）3）0.46±0.10 0.52±0.14 83.541 0.000 F P TLR4/GAPDH 0.49±0.14 1.25±0.271）0.52±0.152）3）2.01±0.342）3）1.27±0.28 1.22±0.31 56.808 0.000 p-PI3K/PI3K 0.38±0.11 1.07±0.231）0.42±0.132）3）1.78±0.292）3）1.10±0.24 1.02±0.18 75.132 0.000 p-AKT/AKT 0.24±0.05 0.96±0.211）0.27±0.082）3）1.68±0.322）3）0.95±0.16 0.92±0.24 85.901 0.000 Bax/GAPDH 0.22±0.03 0.98±0.141）0.26±0.052）3）1.71±0.262）3）0.97±0.12 0.95±0.21 147.369 0.000 0.07±0.02 0.45±0.071）0.10±0.032）3）0.99±0.202）3）0.46±0.08 0.44±0.11 123.008 0.000

3 討論

PE作為一種常見的產(chǎn)科疾病，嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦生命安全和胎兒發(fā)育，還是造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒死亡的重要原因，目前尚無特效治療手段，對于人口質(zhì)量的提升產(chǎn)生較大的負(fù)面影響［14-15］。本文以皮下注射L-NAME的方法誘導(dǎo)建立PE大鼠模型，觀察到大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17水平明顯升高，顯示L-NAME可引發(fā)妊娠大鼠體內(nèi)炎癥，導(dǎo)致大鼠尿蛋白含量和平均動(dòng)脈壓明顯升高，胎盤組織血管生成受損，凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，細(xì)胞大量凋亡，最終造成胎鼠發(fā)育遲緩，體質(zhì)量降低，存活率減少，揭示PE模型建立成功。

胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞是維持胎盤正常功能和胎兒營養(yǎng)支持的重要結(jié)構(gòu)，在PE病理過程中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重凋亡，影響胎兒正常生長發(fā)育［1-2］，而炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致包括胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡在內(nèi)的PE病理過程的主要因素，減輕母體全身炎癥有利于PE的治療［3-4］。木犀草素是一種有顯著抗菌消炎活性的天然黃酮類物質(zhì)，可通過抑制IL-17炎癥信號通路，降低氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖及再生，減輕腦缺血損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用［16-17］，劉翠翠等［10］研究發(fā)現(xiàn)木犀草素還可治療高血壓。本研究以木犀草素干預(yù)處理PE大鼠，可顯著降低其血清IL-6、TNF-α及IL-17水平、平均動(dòng)脈壓、24 h尿蛋白含量，降低胎盤細(xì)胞凋亡比例及凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)，提升抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，增加平均子代數(shù)目、平均子代體質(zhì)量和胎盤組織CD31陽性細(xì)胞比例，表明木犀草素能夠抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減輕PE大鼠體內(nèi)炎癥，降低滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)胎盤血管生成及胎鼠生長發(fā)育，改善大鼠妊娠后期高血壓及蛋白尿癥狀，揭示木犀草素對PE具有較強(qiáng)的治療作用。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TLR4作為與炎癥密切相關(guān)的重要蛋白分子，可通過調(diào)控NF-κB、PI3K/AKT信號參與介導(dǎo)小鼠肝損傷、過敏性鼻炎等炎癥疾病的致病過程，下調(diào)TLR4表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號激活減輕小鼠肝組織炎癥［5，18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路蛋白在早發(fā)型子癇前期患者體內(nèi)表達(dá)明顯升高，可介導(dǎo)PE的發(fā)病過程［8］；另外下調(diào)TLR4表達(dá)還可通過抑制NF-κB信號激活減少PE大鼠炎癥因子合成釋放，進(jìn)而抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，修復(fù)胎盤功能，促使子代存活，改善大鼠PE癥狀［7，20］。另外有研究顯示木犀草素可通過下調(diào)變應(yīng)性鼻炎大鼠TLR4/NF-κB通路表達(dá)，從而改善其鼻黏膜炎癥損傷，因而推測下調(diào)TLR4/PI3K/AKT通路可能是木犀草素治療PE的作用機(jī)制［9］。本文以腺病毒包裝的TLR4過表達(dá)載體上調(diào)PE大鼠TLR4表達(dá)，對此推測進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，木犀草素可以降低PE大鼠胎盤組織TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平，而以腺病毒包裝的TLR4過表達(dá)載體可以促進(jìn)PE大鼠炎癥進(jìn)展，加重其高血壓及蛋白尿癥狀，進(jìn)一步降低子代存活率，并可減弱木犀草素對上述癥狀的改善作用，逆轉(zhuǎn)木犀草素對PE的治療作用，表明木犀草素可通過下調(diào)TLR4/PI3K/AKT通路抑制炎癥反應(yīng)，改善PE臨床癥狀，維持胎盤正常功能，促使胎兒存活。

綜上所述，木犀草素可通過下調(diào)TLR4表達(dá)，減弱PI3K、AKT蛋白的磷酸化，進(jìn)而降低炎癥因子表達(dá)合成，阻礙炎癥反應(yīng)進(jìn)展，減少PE大鼠胎盤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胎盤血管生成，改善大鼠妊娠后期高血壓與蛋白尿癥狀，提高子代存活率，干擾TLR4/PI3K/AKT信號途徑傳導(dǎo)是其藥理機(jī)制之一。本文為木犀草素治療PE提供了支持性證據(jù)，對其臨床的推廣應(yīng)用可能有一定的參考價(jià)值。