血清IL-34表達水平與原發性膽汁性膽管炎的相關性分析

唐笛嬌 王艷萍 鄒麟 陳瀑 李僑 （重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科，重慶 400060）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是主要累及肝內小葉間膽管的器官特異性自身免疫性疾病，可導致膽管上皮細胞死亡、膽囊周圍纖維化、膽汁淤積，若控制不佳可進展為肝纖維化甚至最終發展為肝硬化，已成為最常見的肝內膽道疾病之一［1］。隨著對該疾病認知和檢測水平提高，PBC全球發病率均呈上升趨勢，我國發病率為49.2/10萬［2］。目前PBC診斷基于特異性血清抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）對丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（PDC-E2）的反應（＞95%患者）。PBC起病隱匿，發病機制不明，仍是自身免疫性肝病難點之一。PBC目前被認為是一種多因素多基因疾病，許多動物模型表明，對自身組織（抗原）喪失免疫耐受和產生自身抗體是PBC發生的基礎，在免疫信號、外源修飾蛋白和微生物免疫等共同作用下導致小葉間膽管炎發生［1］。肝內膽管上皮細胞（biliary epithelial cells，BECs）是肝細胞重要組成，其損傷機制是研究PBC發病機制的關鍵。過度活化的T細胞和B細胞是目前研究較多的方向，但仍未解釋PBC中BEC的攻擊特異性。最近一項研究表明，來自膽道小上皮細胞的凋亡小體可誘導PBC患者巨噬細胞分泌細胞因子。AMA存在條件下，PBC患者巨噬細胞、BEC凋亡小體和AMA可組成三聯體，導致炎癥細胞因子暴發［3］。提示巨噬細胞和AMAs與膽管損傷有關，并解釋了PBC的組織特異性。

IL-34是一種新型細胞因子，為分泌型同二聚體糖蛋白，是集落刺激因子1受體（colony-stimulating factors-1R，CSF-1R）的組織特異性配體，可激活多種信號通路，調控巨噬細胞主要功能，包括增殖、分化、生存、代謝、細胞因子/趨化因子表達及細胞黏附和遷移［4］。IL-34結合至CSF-1R有助于髓系細胞增殖和生存。此外，巨噬細胞在PBC患者中起重要作用［4-5］。盡管IL-34被認為是幾種疾病的關鍵診斷指標［6］，但IL-34與PBC、AMA的關系以及與PBC進展的相關性尚未明確。因此，本研究探討IL-34在AMA陽性PBC患者血清中的表達，更好地了解IL-34與PBC的關系，改善對PBC的認知。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集2020年6月至2021年12月重慶醫科大學第一附屬醫院及兩所分院可檢測到AMA-M2陽性的PBC患者49例，女47例，男2例，平均年齡（57.55±14.15）歲。PBC診斷標準符合中華醫學會肝病學分會制定的《原發性膽汁性膽管炎的診斷和治療指南（2021）》［7］。納入標準滿足以下3條標準中的2條：①存在膽汁淤積的生物化學證據，主要為堿性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰轉氨酶（GGT）升高，且影像學檢查排除肝外或肝內大膽管梗阻；②AMA-M2陽性；③組織學上有非化膿性破壞性膽管炎和小膽管破壞證據。排除標準：①合并其他可能引起膽汁淤積相關生化指標升高的疾病，包括病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原發性硬化性膽管炎、肝內局部膽管梗阻、肝外膽管梗阻和藥物性肝損害等；②合并其他自身免疫病，如干燥綜合征；③接受過生物制劑、免疫抑制劑或激素治療。從重慶醫科大學附屬第一醫院體檢中心收集健康對照者50例，平均年齡（55.64±16.21）歲，納入標準：①性別和年齡與其他兩組基本匹配；②身體狀況好，無感冒、消化不良等不適；③既往無自身免疫病、傳染病和腫瘤病史，無自身免疫病和腫瘤相關家族史；④無其他可能引起肝臟酶學和或引起膽汁淤積生化指標升高的疾病。收集每例PBC患者標準化病史并進行體格檢查，9例未經熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）治療的PBC患者入組后均接受13～15 mg/（kg·d） UDCA口服治療。9例患者UDCA治療6個月后再次收集血液樣本。收集PBC患者血清樣本，完成所有患者病史信息和體格檢查。所有患者均要求空腹，禁食8 h，避免血脂影響，早上空腹抽取外周靜脈血4 ml，孵育30 min，3 000 r/min離心6 min，收集血清于EP管，-80 ℃保存。本研究經重慶醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，所有操作按地區倫理委員會指導原則和規范進行，所有參與者知情同意。

1.1.2 試劑與儀器 ELISA檢測試劑盒（R＆amp;D，USA）；生化儀（Cobas 701，Roche，Switzerland）；特定蛋白分析儀（image 800，Beckman，USA）；歐蒙免疫印跡儀（EURO BlotMaster，Euroummun，Germany）；免疫分析儀（YHLO Union，YHLO，中國）；酶標儀（Tecan，奧地利）。

1.2 方法

1.2.1 實驗室數據檢測 實驗室常規檢測項目包括：血常規、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、GGT、ALP、乳酸脫氫酶（LDH）、三酰甘油（TG）、膽紅素（BIL）、IgG、IgM、抗線粒體抗體M2（AMA-M2）及細胞因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α。以上各指標均由實驗室自動化儀器檢測并按照廠家說明書進行測試。率比色法檢測血清AST、ALT、ALP、LDH、GGT、BIL和TG水平。比濁法測定血清IgG和IgM水平。免疫印跡法檢測血清AMA-M2。僅AMA-M2陽性患者進一步定量。ELISA測定人血清AMA-M2濃度，由免疫分析儀自動進行。化學發光法定量測定人血清IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α濃度。所有方法均按生產商操作流程執行。

1.2.2 血清標本IL-34水平測定 根據生產商說明書采用ELISA試劑盒測定血清IL-34水平。收集49例患者和50例健康對照者血清，按照試劑說明書要求制備所有試劑、標準品和樣本。標準品制備：900 μl校準品稀釋液移至100 μl濃度為2 000 pg/ml的原液標準品管，混勻后吸取500 μl轉移至第二管進行對倍稀釋，使用原液產生稀釋系列7管，打開微孔板密封袋，每孔加100 μl稀釋液后每孔加入50 μl待測血清、標準品和對照，膠膜封板，室溫下在水平軌道微孔板搖床上振搖孵育2 h，軌道設置（500±50） RPM，用預先配制的洗滌緩沖液洗板3次，每孔加入400 μl洗滌緩沖液，每次均保證液體拍干無殘留，每孔加入200 μl人IL-34酶結合抗體，膠膜封板，室溫下水平軌道微孔板搖床振搖孵育2 h，重復上述洗板步驟3次，每孔加入200 μl底物溶液，室溫下在桌面避光孵育30 min，每孔加入50 μl終止液，酶標儀在30 min內測定450 nm處吸光度。

1.3 統計學處理 所有數據均采用SPSS21.0軟件進行分析，PBC患者與對照組采用Mann-WhitneyU檢驗分析兩組間差異。采用Mann-WhitneyU檢驗分析IL-34水平與其他連續變量的關系。Spearman相關分析法分析IL-34與其他連續變量的關系。配對T檢驗比較同一患者相同指標治療前后差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本資料 PBC患者和健康對照者年齡、性別匹配，PBC患者血清ALT、AST、GGT、ALP、LDH、TG、BIL、IgG、IgM水平明顯高于健康對照組（P＜0.05，表1），PBC患者臨床表現特點如表2所示，無明顯臨床癥狀患者13例。

表1 PBC患者及健康對照者基本資料（±s）Tab.1 Baseline clinical characteristics of PBC patients and controls （±s）

表1 PBC患者及健康對照者基本資料（±s）Tab.1 Baseline clinical characteristics of PBC patients and controls （±s）

Items Female/Male Age ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）GGT/（U·L-1）ALP/（U·L-1）LDH/（U·L-1）TG/（mmol·L-1）BIL/（mol·L-1）IgG/（g·L-1）IgM/（g·L-1）Control （n=50）48/2 55.64±16.21 18.70±8.64 21.42±4.28 20.88±8.62 71.76±18.25 165.20±25.11 0.93±0.25 11.53±3.61 12.24±1.94 1.45±0.56 PBC （n=49）47/2 57.55±14.15 66.84±87.08 66.84±64.67 158.43±156.27 204.29±249.84 542.73±378.71 2.82±3.51 82.41±138.63 16.79±6.15 2.68±2.70 P 0.683 0.625 0.024 0.017 0.020 0.018 0.024 0.016 0.014 0.032 0.034

表2 PBC患者臨床表現Tab.2 Clinical manifestation of PBC patients

2.2 PBC患者血清IL-34水平升高 比較49例PBC患者和50例健康對照者血清IL-34水平以探討IL-34在PBC發病中的作用，結果顯示PBC患者IL-34水平明顯高于健康對照組［82.37（22.57～264.20） pg/mlvs37.67（28.87～63.54） pg/ml，P＜0.05，圖1］。

圖1 PBC患者和健康對照者血清IL-34表達Fig.1 Serum IL-34 level in healthy control subjects and patients with PBC

2.3 IL-34與AMA-M2的相關性分析 AMA-M2是PBC最特異的標志物，AMA存在下巨噬細胞被激活。收集數據的所有患者均檢測到AMA-M2，ELISA對AMA-M2進行血清學定量檢測，結果顯示IL-34升高與AMA-M2定量相關（r2=0.16，P＜0.042，圖2A），但相關系數不佳，尚不足以證實正相關結論，需進一步討論。

圖2 血清IL-34與各指標的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between serum IL-34 and each index

2.4 PBC患者血清IL-34水平與肝功能指標及免疫球蛋白的關系 IL-34水平與ALT（r2=0.048，P=0.12）、AST（r2=0.007 9，P=0.54）、GGT（r2=0.002 8，P=0.71）、ALP（r2=0.001 4，P=0.79）、LDH（r2=0.05，P=0.12）、TG（r2=0.023，P=0.28）、BIL（r2=0.024，P=0.28）、IgG（r2=0.029，P=0.23）、IgM（r2=0.003 1，P=0.71）等均無顯著相關關系（圖2B～J）。

2.5 PBC患者血清IL-34水平與臨床表現的關系PBC患者臨床表現存在顯著個體差異。肝組織病理學檢查并非診斷必需，僅少數患者有肝組織活檢結果，無法根據肝臟病理學表現對入組患者進行分期。根據臨床癥狀（表2）和肝功能指標（表1）將患者分為3組：Ⅰ組無癥狀，僅肝功能指標異常；Ⅱ組有臨床癥狀及肝功能指標異常，但無肝硬化；Ⅲ組為肝硬化組。比較IL-34水平差異，結果顯示血清IL-34水平在不同臨床表現間差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

2.6 PBC患者血漿細胞因子濃度 如表4所示，PBC組血清IL-2、IL-6和TNF-α濃度顯著高于健康對照組。PBC血清IL-1、IL-8、IL-10濃度較健康對照組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 PBC患者炎癥細胞因子濃度 ［Median （min～max）］Tab.4 Serum cytokine levels in patients with PBC and healthy controls ［Median（min-max）］

2.7 PBC患者血清IL-34水平與血清細胞因子水平的關系 分析PBC中IL-34與IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等細胞因子的關系，IL-34與IL-1（r2=0.030，P=0.23）、IL-2（r2=0.002，P=0.72）、IL-6（r2=0.020，P=0.29）、IL-8（r2=0.050，P=0.12）、IL-10（r2=0.010，P=0.60）、TNF-α（r2=0.010，P=0.51）均無顯著相關性（圖3）。

圖3 血清IL-34與炎癥細胞因子的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between serum IL-34 and inflammatory cytokines

2.8 PBC患者血清IL-34水平治療前后對比 UDCA是治療PBC的一線藥物，選取9例治療前血清IL-34較健康對照明顯升高的患者進行隨訪，UDCA治療后進行血清IL-34檢測，結果表明PBC患者經UDCA治療后血清IL-34水平顯著降低（P=0.023，圖4）。

圖4 血清IL-34治療前后變化Fig.4 Changes of serum IL-34 before and after treatment

3 討論

PBC被認為是一種典型的自身免疫性疾病，其特點為存在抗線粒體抗體AMA和BEC特異性破壞結果。免疫抑制劑已被證明對PBC幾乎無效果［8］。PBC病因機制復雜，小膽管上皮細胞的靶向特異性是PBC發病機制的主要未解問題。所有有核細胞均有線粒體，但PBC中僅有肝內BECs和較小的唾液腺細胞是自身免疫攻擊的目標。已有文獻證明BECs可將免疫完整的PDC-E2轉移至凋亡小體并形成凋亡細胞，確定研究巨噬細胞能夠解釋PBC的器官特異性［3］。深入了解巨噬細胞的預測指標及其在PBC進展中的功能作用對改善預后和治療有重要意義。本研究表明PBC患者血清IL-34水平顯著升高，并在一線藥物治療后顯著降低，血清IL-34和AMA-M2存在一定相關性。

IL-34是CSF-1R的替代配體，可促進吞噬細胞增殖、存活、分化等多種生理功能和病理過程［9］。與僅和CSF-1R結合的CSF-1相比，IL-34可通過許多信號網絡與CSF-1R、PTPz和CD138結合，在某些細胞亞群中產生部分重疊作用，發揮對巨噬細胞的調節作用［4］。

研究表明IL-34在肝臟病變進展中發揮關鍵作用，是慢性肝炎及肝組織炎癥、纖維化患者的血清學指標［10］。免疫激活被認為參與PBC發病機制，其中巨噬細胞激活是最受關注的。LLEO等［3］證實AMA存在下，膽道小上皮細胞凋亡小體可刺激患者巨噬細胞釋放強烈的炎癥細胞因子。CD1a陽性的朗格漢斯細胞可能存在于PBC患者膽道上皮中［11］。越來越多的證據表明IL-34在單核吞噬細胞系增殖和分化、破骨細胞形成和炎癥中發揮重要作用［6］。PBC患者單核細胞來源巨噬細胞與膽道小上皮細胞凋亡小體培養后，在AMAs存在下可顯著增加TNF-α相關凋亡誘導配體表達［12］。推測IL-34在PBC患者中對巨噬細胞激活可能發揮重要作用，為證實該假設，本研究全部選取AMA陽性PBC患者，各種類型（M1～M9）中，M2被認為是診斷最特異的，但滴度與PBC疾病嚴重程度無關［13］。

患者基本資料調查顯示，PBC部分患者無癥狀，但由于對該病認知不足，仍有約1/3患者出現了肝硬化，部分患者初診時肝功能損傷較為嚴重，促進該病的普及尤其是偏遠地區，路仍然很長。

本研究證實血清IL-34在PBC患者中有顯著的表達上調趨勢，并與PBC患者其他炎癥因子水平顯著相關。與健康對照組相比，PBC患者血清IL-2、IL-6和TNF-α等炎癥細胞因子顯著升高。但與預期一樣，IL-34表達與肝功能指標、免疫球蛋白、病情嚴重程度及血清炎癥白介素表達無顯著相關性，但患者經過治療后，血清IL-34表達顯著下降，提示IL-34對PBC患者疾病發生及巨噬細胞激活有一定作用，但與疾病發展無顯著相關性。報道顯示IL-6增強IL-34誘導免疫抑制巨噬細胞分化的病理過程［14］。IL-34引起的巨噬細胞活化可誘導分泌炎癥細胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，其下游作用可在AMA存在情況下進一步損傷BECs［15］。本研究雖表明血清IL-34和AMA-M2存在一定相關性，但經過結果討論后認為目前數據尚不足以支持IL-34和AMA-M2定量結果存在正相關關系，且IL-34表達與疾病嚴重程度無關，需要更大樣本量對該結果進行驗證。

膽汁上皮細胞的免疫損傷循環導致膽汁淤積和肝細胞纖維化。PBC免疫學發病機制復雜。參與破壞膽管的免疫細胞包括T細胞、B細胞、單核細胞和巨噬細胞，T細胞和B細胞在PBC中的作用已有一些研究［16］。因此本研究關注單核-巨噬細胞系統。IL-34在單核吞噬細胞、譜系細胞和炎癥增殖分化中起重要作用［17-18］。PBC中通過T和B細胞相互作用，AMAs產生特定于PDC-E2的組分，激活免疫細胞（包括巨噬細胞）。只有在AMAs存在情況下，PBC患者巨噬細胞與人BEC凋亡小體培養后才會分泌促炎細胞因子，包括高水平的IL-6（促炎，誘導IL-34表達）、IL-17（促炎，誘導IL-34表達）和TNF-α（誘導BEC凋亡或衰老）［19］。BECs死亡后進一步釋放PDC-E2，產生更多凋亡小體，IL-34介導一個正反饋回路促進巨噬細胞增殖分化。另一方面，IL-34是一種參與纖維原性巨噬細胞活化誘導的細胞因子，與肝纖維化和炎癥嚴重程度相關［20］。綜上，AMA存在下，IL-34介導的巨噬細胞激活對BEC造成了特異性損傷。

本研究證明IL-34血清表達在AMA-M2陽性PBC患者中升高，并在治療有效患者中水平明顯降低。PBC患者血清IL-34表達與部分炎癥因子呈正相關，提示AMA存在情況下，IL-34介導的巨噬細胞活化對肝BEC造成了特異性損傷。本研究揭示IL-34可能是PBC發生和潛在治療的重要炎癥介質，血清IL-34可能成為PBC的候選生物標志物。

(3)在區域內部不平等貢獻率中，城市群地區對總的收入不平等程度的貢獻占比最高并不斷提升，從1986年與非城市群地區對總的收入不平等貢獻率從36.7∶62.0上升到2014年24.5∶72.9。其結果意味著，城市群地區對總收入不平等的貢獻率比重將進一步提升，這可能是由于城鎮化引起的，因此中國在未來加快城鎮化過程的同時要防范區域收入不平等的進一步加劇。

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