miR-410-3p通過靶向YAP1調節IL-22誘導的人角質形成細胞增殖和凋亡

孫敏 任虹 （連云港市第一人民醫院皮膚科，連云港 222000）

銀屑病是一種常見的慢性、易復發的皮膚炎癥性疾病，影響世界2%～3%人口，嚴重時可降低患者生活質量［1］。銀屑病主要表現為角質形成細胞異常增生和分化、免疫細胞過度浸潤、炎癥因子釋放等［2-3］。IL-22是免疫細胞產生的在皮膚中僅作用于角質形成細胞的一種炎癥因子，在銀屑病患者患病組織和血清中表達增多，且與疾病嚴重程度相關［4］。體外常用IL-22刺激角質形成細胞模擬銀屑病模型［5-6］。miRNAs是由約22個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼RNAs，在包括銀屑病在內的多種疾病中發揮重要作用［7-8］。miR-410-3p不僅可調節細胞生長，還可調節免疫細胞和非免疫細胞炎癥反應［9-10］。如miR-410-3p可調控骨關節炎小鼠軟骨細胞凋亡和炎癥以及吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾病中支氣管上皮細胞增殖和凋亡［11-12］。考慮到炎癥和角質形成細胞增殖在銀屑病中的重要作用，以及miR-410-3p可參與炎癥反應和細胞生長，本研究推測miR-410-3p可能與銀屑病發生存在某種聯系。因此，本研究檢測miR-410-3p在銀屑病患者血清中的表達，并利用IL-22處理人角質形成細胞HaCaT建立體外銀屑病模型，探討miR-410-3p對IL-22誘導的角質形成細胞生長的影響及可能分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 收集2020年10月至2020年12月就診于連云港市第一人民醫院的12例尋常型銀屑病患者空腹靜脈血作為實驗組，年齡23～59歲，男7例，女5例。納入標準：①既往無心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等；②樣本采集前2個月內未使用糖皮質激素類、甲氨蝶呤、維A酸類、環孢素類等全身治療藥物以及依那西普等生物制劑；③采樣前至少1個月內未接受紫外線照射治療；④不在妊娠期和哺乳期。另外收集連云港市第一人民醫院同期體檢的年齡、性別無差異的12例健康志愿者空腹靜脈血作為對照組。所有研究對象均知情同意。本研究經連云港市第一人民醫院倫理委員會審批（2020-005）。將收集的實驗組和對照組血液樣本放入含肝素的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清樣本。

1.1.2 主要試劑 人角質形成細胞系HaCaT購自中國科學院昆明細胞庫；胎牛血清購自美國Hyclone公司；DMEM培養基和胰酶購自美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖試劑盒購自南京貝博生物；Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天公司；TaqMan microRNA assay試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；Lipofecatmine 3000轉染試劑、M-MLV Reverse Transcriptase購自美國Invitrogen公司；SYBR?Green PCR試劑盒購自美國Promega公司；Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）、GAPDH兔單克隆抗體以及HRP標記的抗兔IgG抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；miR-410-3p及其對照序列（miR-NC）、PCR引物均由上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養基培養HaCaT細胞，細胞達到對數生長期時胰酶消化，接種于細胞培養板常規培養24 h，將細胞分為4組：對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組。除對照組外，其余3組均用IL-22刺激，建立體外銀屑病模型，刺激濃度和時間參考文獻［13］：將完全培養基更換為無血清DMEM培養基饑餓處理24 h，加入100 ng/ml IL-22刺激24 h。miR-NC組和miR-410-3p組加入IL-22刺激前48 h時根據Lipofectamine 3000試劑說明書轉染miR-NC和miR-410-3p。將HaCaT細胞分為3組：miR-410-3p組、miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組。miR-410-3p組處理方法同前，miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組轉染miR-410-3p同時轉染pcDNA3.1質粒和構建的pcDNA3.1-YAP1質粒。

1.2.2 細胞增殖檢測 CCK-8檢測細胞活力：將細胞接種于96孔板，2.5×103個/孔，按1.2.1分組對細胞進行處理。加入IL-22后24 h分別檢測細胞活力：各孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃放置2 h，酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度。BrdU檢測細胞增殖：各組細胞接種至24孔板，每孔添加BrdU繼續孵育12 h，棄培養液，甲醇固定10 min，2 mol/L HCl變性5 min，加入3%BSA封閉1 h，加入BrdU一抗4 ℃孵育12 h，加入二抗室溫孵育1 h，DAPI染核，熒光顯微鏡拍照后計算BrdU陽性細胞數。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將HaCaT細胞按5×105個/孔接種于6孔板，按1.2.1轉染miRNA和進行IL-22刺激，IL-22刺激24 h后胰酶消化，收集細胞至離心管，1 000 g離心5 min，去除上清，PBS重懸，調整細胞密度至1×106個/ml。1 000 g離心5 min，去除上清，加入195 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加5 μl Annexin V-FITC與細胞混勻，再加入10 μl碘化丙啶（PI）染色液混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-410-3p和YAP1 mRNA表達 Trizol試劑提取患者血清和HaCaT細胞總RNA，參考試劑說明書操作。用相應試劑盒將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA，使用PCR試劑盒進行qRTPCR檢測miR-410-3p和YAP1 mRNA表達，結果用2-ΔΔCt分析，分別以U6和GAPDH為內參。引物序列miR-410-3p F：5'-ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG-3'；R：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；YAP1 F：5'-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3'；R：5'-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3'；GAPDH F：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'；R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.2.5 YAP1蛋白水平檢測 收集細胞，使用冰冷的含PMSF的RIPA裂解液裂解30 min。離心收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，各樣品取30 μg總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至0.45 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入YAP1和GAPDH一抗4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，加入ECL化學發光試劑顯色，拍照，Image J軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH為內參，計算YAP1蛋白表達。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因分析miR-410-3p與YAP1的靶向關系 PCR擴增含miR-410-3p結合序列的YAP1野生型和突變型3'端非編碼區序列，將這兩段序列分別插入pmirGLO載體，構建YAP1野生型（YAP1-WT）與YAP1突變型（YAP1-MUT）質粒。將HaCaT細胞接種于24孔板，過夜常規培養后轉染20 nmol/L miR-410-3p或miR-NC和50 ng構建的質粒，轉染48 h，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學方法 計量資料用±s表示。采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，使用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-410-3p在各組血清樣品中的表達 qRTPCR檢測血清miR-410-3p表達（圖1）：健康對照組和實驗組銀屑病患者血清miR-410-3p表達分別為1.00±0.16和0.44±0.11。與健康對照組相比，實驗組銀屑病患者血清miR-410-3p表達降低（t=10.09，P＜0.05）。

圖1 健康志愿者和銀屑病患者血清miR-410-3p表達Fig.1 miR-410-3p expression in serum of healthy and psoriasis patients

2.2 各組細胞miR-410-3p表達 對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組中miR-410-3p表達分別為1.00±0.04、0.42±0.09、0.43±0.11、1.37±0.13。IL-22組miR-410-3p表達低于對照組，miR-410-3p組miR-410-3p表達高于IL-22組（均P＜0.05，圖2）。

圖2 各組細胞miR-410-3p表達Fig.2 miR-410-3p expression in cells of different groups

2.3 過表達miR-410-3p抑制IL-22誘導的HaCaT細胞增殖 CCK-8檢測各組細胞活力，對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組細胞450 nm處吸光度分別為0.61±0.06、0.90±0.07、0.92±0.08和0.69±0.06。IL-22組細胞活力較對照組增強，miR-410-3p組細胞活力較IL-22組減弱（均P＜0.05，圖3A）。對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組BrdU陽性細胞占比分別為（22.67±2.52）%、（74.67±7.09）%、（72.00±6.01）%、（33.65±4.16）%。IL-22組BrdU陽性細胞多于對照組，miR-410-3p組BrdU陽性細胞少于IL-22組（均P＜0.05，圖3B、C）。

圖3 過表達miR-410-3p抑制IL-22誘導的HaCaT細胞增殖Fig.3Overexpression of miR-410-3p inhibits proliferation of HaCaT cells induced by IL-22

2.4 過表達miR-410-3p促進HaCaT細胞凋亡 流式細胞術檢測各組細胞凋亡（圖4）：對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組細胞凋亡率分別為（26.11±2.09）%、（7.79±1.30）%、（8.12±0.90）%和（22.91±1.58）%。IL-22組細胞凋亡率較對照組降低，miR-410-3p組細胞凋亡率較IL-22組升高（均P＜0.05）。

圖4 過表達miR-410-3p促進HaCaT細胞凋亡Fig.4 Overexpression of miR-410-3p increases apoptosis of HaCaT cells

2.5 IL-22刺激的HaCaT細胞中miR-410-3p可靶向調節YAP1表達 Starbase生物信息學分析發現miR-410-3p有多個潛在靶基因，YAP1是這些基因中的一個，結合序列見圖5A。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，YAP1-WT細胞中，miR-410-3p組熒光素酶活性低于miR-NC組（0.46±0.08vs1.00±0.06；t=10.07，P＜0.05）；但轉染YAP1-MUT的細胞中miR-410-3p組和miR-NC組熒光素酶活性差異無統計學意義（1.01±0.08vs0.98±0.12；t=0.31，P=0.77，圖5B）。對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組YAP1 mRNA表達分別為1.00±0.06、3.39±0.21、3.31±0.28和1.51±0.12（圖5C）。對照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組YAP1蛋白水平分別為0.09±0.03、0.62±0.05、0.59±0.08和0.21±0.04（圖5D）。IL-22組YAP1 mRNA和蛋白水平均比對照組升高，miR-410-3p組YAP1 mRNA和蛋白水平均較IL-22組降低（均P＜0.05，圖5C、D）。

圖5 IL-22刺激的HaCaT細胞中miR-410-3p可靶向調節YAP1表達Fig.5 miR-410-3p targets YAP1 and regulates its expression in IL-22 stimulated HaCaT cells

2.6 過表達YAP1可逆轉miR-410-3p對IL-22誘導的HaCaT細胞增殖和凋亡的影響 miR-410-3p組、miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組細胞450 nm處吸光度分別為0.68±0.05、0.67±0.06和0.89±0.04；凋亡率分別為（22.91±1.58）%、（23.07±2.06）%和（12.31±2.22）%。與miR-410-3p組相比，miR-410-3p+YAP1組中細胞活力增強，凋亡率降低（均P＜0.05）；而miR-410-3p+pcDNA3.1組細胞活力和凋亡率與miR-410-3p組差異無統計學意義（均P＞0.05，圖6）。

圖6 過表達YAP1可逆轉miR-410-3p對IL-22誘導的HaCaT細胞增殖和凋亡的影響Fig.6 Overexpression of YAP1 reverses influences of miR-410-3p on proliferation and apoptosis of HaCaT cells induced by IL-22

3 討論

越來越多的研究證實miRNAs表達異常與銀屑病發生密切相關。如miR-210在銀屑病患者和小鼠模型中均高表達，可通過誘導Th1和Th17細胞分化促進銀屑病相關炎癥反應［7］。WANG等［8］研究發現銀屑病小鼠皮膚組織中miR-383表達下調，銀屑病小鼠模型中過表達miR-383可通過靶向LCN2緩解銀屑病相關癥狀，抑制炎癥反應和JAK3/STAT3通路活化，阻止角質形成細胞增殖，促進其凋亡。銀屑病患者皮膚組織和IL-22刺激的HaCaT細胞模型中miR-617表達上調。IL-22誘導的細胞中，過表達miR-617顯著促進細胞增殖，抑制細胞凋亡［5］。miR-221-3p在銀屑病患者血清中表達顯著增加，血清中miR-221-3p表達與患者TNF-α、IL-17和IL-22表達呈正相關。HaCaT細胞模型中下調miR-221-3p可抑制細胞增殖和炎癥因子釋放。miR-410-3p在慢性阻塞性肺疾病患者血清中表達降低，且與細胞增殖和炎癥均相關［9-10，12］。因此，本課題探索了miR-410-3p在銀屑病患者血清中的表達，發現其在患者血清中含量顯著低于健康志愿者，表明miR-410-3p可能與銀屑病發生存在一定聯系。

IL-22在銀屑病中不僅可調控炎癥反應，還可促進角質形成細胞增殖，抑制其凋亡［14］。本研究也證實IL-22可促進HaCaT細胞增殖，減少細胞凋亡。IL-22刺激的HaCaT細胞模型中也發現miR-410-3p表達下調，與其在銀屑病患者血清中的表達趨勢一致。本研究在細胞模型中進一步探究了miR-410-3p對IL-22刺激的角質形成細胞增殖和凋亡的影響，結果顯示過表達miR-410-3p顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，進一步證實miR-410-3p在銀屑病發生過程中發揮重要作用。

研究顯示miRNAs通過靶向調控mRNA發揮生物學作用［8，15］。本研究進一步探究了miR-410-3p的作用機制。YAP1是Hippo通路的關鍵分子，可調控細胞增殖與凋亡、組織生長發育、上皮-間質轉化、胞內接觸抑制和干細胞自我更新等多種生物學作用。由于這些作用，YAP1在多種腫瘤中是一個常見的促癌基因。近年研究發現YAP1在銀屑病患者皮膚和銀屑病小鼠模型中表達上調，下調YAP可抑制HaCaT細胞增殖，促進凋亡［16］；且藥物可通過抑制YAP1表達在銀屑病小鼠和細胞模型中抑制表皮角質形成細胞異常增殖［17］。本研究發現IL-22誘導的HaCaT細胞中YAP1表達上調。Starbase生物信息學分析miR-410-3p的靶基因時發現YAP1是其潛在的靶基因。因此本研究進一步檢測了miR-410-3p與YAP1的聯系，構建YAP1野生型和突變型熒光質粒發現miR-410-3p可抑制轉染YAP1野生型質粒的HaCaT細胞熒光素酶活性，但對轉染突變型質粒的熒光素酶活性幾乎無影響，且過表達miR-410-3p顯著抑制YAP1表達，進一步證實YAP1是miR-410-3p的靶基因。此外，IL-22誘導的銀屑病細胞模型中，過表達YAP1可逆轉miR-410-3p對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響。miR-410-3p可能還存在其他靶基因，如Smad7等。JIA等［18］研究表明miR-410-3p可靶向Smad7。而Smad7可促進銀屑病中角質形成細胞增殖［19］。因此，miR-410-3p在銀屑病中的作用機制有待進一步探究。

總之，本研究發現miR-410-3p在銀屑病患者血清中表達降低，HaCaT細胞IL-22可抑制miR-410-3p表達，miR-410-3p可通過靶向YAP1抑制IL-22誘導的角質形成細胞增殖，促進IL-22抑制的細胞凋亡，揭示了銀屑病發生發展的新機制，為銀屑病治療提供了新靶點。