近紅外光譜法快速檢測(cè)何首烏炮制過程中多糖含量的研究

賈 彬，陳啟文，賴嘉敏，張龍開，向超群，郭 拓，程 敏，肖 雪*

（1.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東省藥品檢驗(yàn)所），廣東 廣州 510663；2.廣東藥科大學(xué) 廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心（中醫(yī)藥研究所），廣東 廣州 510006；3.弘正道（中國(guó)）中藥研究有限公司，廣東 廣州 510665；4.陜西科技大學(xué) 電子信息與人工智能學(xué)院，陜西 西安 710021）

何首烏為蓼科植物何首烏（Pleuropterus multifloruThunb.）的干燥塊根，多以生首烏和制首烏做藥用。制首烏是生首烏的加工品，有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)、化濁降脂的作用。何首烏經(jīng)炮制后，瀉下作用降低，補(bǔ)益作用增強(qiáng)，呈明顯的“生熟異用”功效。近代藥理學(xué)研究顯示，何首烏在抗衰老、抗腫瘤、改善心血管功能、增強(qiáng)免疫力等方面具有良好的療效［1-3］。而何首烏多糖作為何首烏中的主要藥效成分，具有極高的藥理活性，包括抗衰老［4］、抗炎［5］、降血脂［6］、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)［7］等多種作用。多糖在炮制過程中的變化是何首烏藥性改變的主要原因。現(xiàn)有研究多聚焦在古法炮制何首烏過程中多糖結(jié)構(gòu)和含量的變化等，但古法炮制何首烏中含有黑豆多糖，難以闡釋炮制過程對(duì)何首烏多糖的影響。因此有必要建立一種可以快速準(zhǔn)確地分析何首烏炮制過程中多糖含量變化的方法。

近紅外光譜技術(shù)具有快速、無(wú)損、綠色等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥［8］、化工［9］、食品［10］等領(lǐng)域。姬生國(guó)團(tuán)隊(duì)基于近紅外光譜技術(shù)分別開展了制何首烏中二苯乙烯苷、游離蒽醌、醇溶性浸出物、水分等指標(biāo)的快速測(cè)定研究［11-14］，為何首烏藥材合規(guī)性快檢提供了技術(shù)支持。

但復(fù)雜樣品的近紅外光譜存在譜帶寬、吸收峰重疊等問題，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)光譜進(jìn)行模型校正［15］。同時(shí)，由于檢測(cè)儀器的影響，近紅外光譜信號(hào)中的背景、噪聲、基線、雜散光等會(huì)影響模型質(zhì)量，需對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理［16］。

本研究以何首烏清蒸炮制過程中多糖的含量變化為基礎(chǔ)，采用傅里葉變換紅外光譜儀采集何首烏的近紅外光譜數(shù)據(jù)，并通過偏最小二乘法（PLS）對(duì)樣本光譜進(jìn)行校正。采用SG 平滑、變量標(biāo)準(zhǔn)化（SNV）、一階解卷積導(dǎo)數(shù)（1stDec）、二階解卷積導(dǎo)數(shù)（2ndDec）對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。同時(shí)，為提高模型的預(yù)測(cè)能力及穩(wěn)定性，選擇競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)采樣（CARS）、蒙特卡洛無(wú)信息變量消除法（MCUVE）、隨機(jī)蛙跳法（RF）對(duì)光譜變量進(jìn)行篩選。在此基礎(chǔ)上建立了快速準(zhǔn)確的何首烏多糖定量分析模型，以為何首烏炮制過程的狀態(tài)分析等研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

MPAⅡ型傅里葉變換近紅外光譜分析儀（德國(guó)布魯克公司）；UV-3100PC 型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ELGA 超純水機(jī)（法國(guó)威立雅集團(tuán)）；Sartorius BS110S 萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；LD-200 型高速多功能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。布魯克近紅外光譜分析軟件OPUS 8.5（德國(guó)布魯克公司）、MATLAB R2020b（美國(guó)MathWorks公司）、Unscrambler X 10.4（64-bit）（挪威Camo analytics公司）。

無(wú)水乙醇、濃硫酸（分析純），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），葡萄糖（廣州化學(xué)試劑廠），蒽酮（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

生何首烏（產(chǎn)地廣東，批號(hào)20211260）、黑豆制何首烏（產(chǎn)地貴州，批號(hào)D2012132）均由弘正道（中國(guó)）中藥研究有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制何首烏的制備參照《中國(guó)藥典》［17］2020 年版通則（0213）蒸法炮制加工制何首烏。分別取約10 kg 何首烏片，加入6 700 mL 超純水，拌勻，靜置過夜使汁吸盡，隔水加熱，分別在0、2、4、8、12、18、24、30、36、48 h 取出一定量樣品，曬干，得到10 批清蒸制何首烏樣品，依次標(biāo)記為Q0、Q2、Q4、Q8、Q12、Q18、Q24、Q30、Q36、Q48。

1.2.2 多糖的制備以上述不同清蒸時(shí)間的何首烏與市售制何首烏（標(biāo)記為Z）共計(jì)11 批次樣品為對(duì)象，在各批次樣品中隨機(jī)取6份作為獨(dú)立樣本，共收集何首烏樣品66個(gè)。

1.2.2.1 何首烏樣品預(yù)處理精密稱定何首烏樣品100 g（過20目篩），置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入80%乙醇1 000 mL，加熱回流1 h除去藥材中的脂溶性成分，趁熱過濾，濾渣用80%乙醇洗滌至無(wú)色，揮干表面殘留的醇溶液，干燥至恒重備用。

1.2.2.2 何首烏多糖的提取［18］按照料液比1∶25 的比例將預(yù)處理的樣品與純凈水置于圓底燒瓶中，提取2.5 h；第二次按料液比1∶20，提取2 h。趁熱過濾，合并水提液后濃縮至100 mL，隨后緩慢加入無(wú)水乙醇至醇含量達(dá)60%，搖勻，置于4 ℃冰箱靜置8 h。取出，在濾餅中依次加入丙酮、石油醚2～3次進(jìn)行抽濾操作，烘干濾餅即得到何首烏水提粗多糖固體。精密稱定各何首烏水提粗多糖15 mg，加適量熱水溶解并定容至250 mL容量瓶中備用。

1.3 蒽酮-硫酸法測(cè)定何首烏粗多糖中的單糖含量

移取2 mL 待測(cè)液置于比色管中，加入6 mL 蒽酮-硫酸試劑，劇烈振蕩搖勻，浸于冰水浴中冷卻，于100 ℃水浴煮沸5 min，取出，在冰水浴中冷卻后于625 nm下測(cè)定吸光度值。

1.4 近紅外光譜采集

何首烏樣品粉末的近紅外光譜均使用MPAⅡ型傅里葉變換近紅外光譜分析儀獲得。采用MATLAB 2020b、Unscrambler X 10.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。光譜測(cè)定條件：光譜范圍11 550～3 950 cm-1，掃描次數(shù)32 次，分辨率16 cm-1，軟件為OPUS 8.5。以每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次后的平均光譜作為該樣品的光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 何首烏多糖含量測(cè)定方法學(xué)考察

移取2 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入6 mL 蒽酮-硫酸溶液，劇烈振蕩搖勻，浸于冰水浴中冷卻3 min，再置于100 ℃水浴中煮沸5 min取出，冰浴3 min，于440～800 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示樣品在625 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立配制質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1、0.15 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取2 mL 測(cè)定其吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，硫酸-蒽酮法測(cè)定的葡萄糖在0.02～0.15 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=4.807 4X+0.095 4，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 5。

2.1.2 精密度分別吸取Q0樣品粗多糖溶液2 mL 至7個(gè)比色管中，測(cè)定吸光度值，計(jì)算得到各樣品質(zhì)量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性平行制備Q0 樣品粗多糖溶液7 份，分別測(cè)定吸光度值，計(jì)算得到各樣品質(zhì)量濃度的RSD為1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性取Q0 樣品粗多糖溶液2 mL，測(cè)定吸光度值，以第一次測(cè)量的時(shí)間為0 min，分別測(cè)定0、10、20、30、40、50、60 min 時(shí)樣品的吸光度值，計(jì)算得到各樣品質(zhì)量濃度的RSD 為1.4%，表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率平行制備Q0 樣品粗多糖溶液6份，分別加入已知樣品含量相當(dāng)?shù)钠咸烟菢?biāo)準(zhǔn)品固體，在625 nm 下測(cè)定吸光度值，計(jì)算得到平均加標(biāo)回收率為98.6%，RSD為2.5%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 不同炮制時(shí)間點(diǎn)的清蒸何首烏粗多糖及其單糖含量

為闡明何首烏炮制過程中多糖的含量變化情況，同時(shí)為建立近紅外定量模型提供多糖真實(shí)信息，對(duì)不同炮制時(shí)間點(diǎn)的清蒸何首烏粗多糖及其單糖含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，清蒸過程中何首烏多糖的含量先升高后降低并逐漸趨于平穩(wěn)，總體呈上升趨勢(shì)（如圖1）。市售制何首烏多糖含量為29.06%，與實(shí)驗(yàn)室制清蒸何首烏多糖含量相當(dāng)。許煜迪［19］發(fā)現(xiàn)清蒸法炮制何首烏48 h，多糖類成分含量逐漸升至31.39%，單糖和二糖類成分含量逐漸降低，糖類成分總含量呈上升趨勢(shì)。結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)［20］，隨著炮制的不斷深入，何首烏多糖的分子量逐漸降低。表明高溫炮制過程中單糖、二糖以及多糖的糖鏈發(fā)生斷裂，使得其水溶性增加、黏度降低、多糖溶出度增高，提高了多糖的生物活性［21］。但何首烏經(jīng)炮制后轉(zhuǎn)化為分子量較小的糖類成分，是否對(duì)其功效活性產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步研究。

圖1 清蒸過程何首烏多糖含量變化Fig.1 Changes of polysaccharide content in Polygoni Multiflori during steaming process

2.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)

各樣品的近紅外光譜如圖2A所示。結(jié)果顯示，何首烏在清蒸過程不同時(shí)間點(diǎn)的樣品光譜呈現(xiàn)基本相似的趨勢(shì)，然而由于頻帶重疊程度較高，導(dǎo)致目標(biāo)組分的特征波長(zhǎng)難以確定。因此，有必要對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，以提高信噪比、消除無(wú)效變異、提升模型質(zhì)量。

圖2 不同預(yù)處理方式的清蒸何首烏近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectra of steamed Polygoni Multiflori with different pretreatment methods

2.4 預(yù)處理方法選擇

SG 平滑、SNV、1stDec、2ndDec 是常見的預(yù)處理方法，SG 可去除噪聲，提高信噪比；導(dǎo)數(shù)處理可放大關(guān)鍵信號(hào)，減少背景效應(yīng)對(duì)信號(hào)的干擾；SNV 可消除因顆粒大小不同或分布不均導(dǎo)致的散射現(xiàn)象對(duì)光譜的影響。另外，由于光譜變量較多，無(wú)關(guān)變量的引入可導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力降低［22］，需對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。CARS、MCUVE、RF 是較為常用的變量篩選方法。CARS 是一種用于多目標(biāo)優(yōu)化的進(jìn)化算法，魯棒性高，具有較強(qiáng)的自適應(yīng)性，但面對(duì)高維問題時(shí)速度較慢［23］。MCUVE 是一種通用的特征選擇方法，該算法不依賴特定的數(shù)據(jù)，適用于各種類型的光譜數(shù)據(jù)，亦能處理數(shù)據(jù)中的干擾因素，提高模型的穩(wěn)定性，但存在計(jì)算復(fù)雜性高、容易丟失相關(guān)性高的特征數(shù)據(jù)等缺點(diǎn)，需根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和評(píng)估［24］。RF具有全局搜索能力強(qiáng)、簡(jiǎn)單和種群多樣的優(yōu)點(diǎn)，但收斂速度慢、參數(shù)選擇困難且易陷入局部最優(yōu)，需根據(jù)具體問題和需求綜合考慮其優(yōu)缺點(diǎn)，并進(jìn)行合理的參數(shù)設(shè)置和調(diào)整［25］。

2.5 聚類分析

聚類分析可利用樣本的光譜特征，將具有相似或相同特征的樣本進(jìn)行聚類，并根據(jù)樣本間的相似度來(lái)確定聚集順序。相似度最大的樣本將被首先聚集，最終得到不同類別或顯著共性特征的聚合結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用Ward’s 方法對(duì)不同清蒸時(shí)間的何首烏樣品粉末的光譜進(jìn)行聚類分析（圖3），結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)的何首烏樣品差異顯著，在含量上可能有較大的差異。

圖3 不同清蒸時(shí)間何首烏樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of Polygoni Multiflori with different steaming times

2.6 多糖含量模型分析

2.6.1 樣本集劃分將不同清蒸時(shí)間的何首烏粉末隨機(jī)取樣后測(cè)定多糖含量，并測(cè)定其光譜數(shù)據(jù)用于建立多糖含量的定量模型，共得到66個(gè)樣本。利用K-S算法將樣本集劃分成校正集和預(yù)測(cè)集，其中校正集44個(gè)樣本，預(yù)測(cè)集22個(gè)樣本，數(shù)據(jù)集劃分結(jié)果如表1所示。校正集的樣品數(shù)據(jù)范圍包含了預(yù)測(cè)集的樣品數(shù)據(jù)范圍，說明該數(shù)據(jù)方法合理有效。

表1 模型樣本集分類結(jié)果Table 1 Classification results of sample collection

2.6.2 預(yù)處理方法優(yōu)化樣品的近紅外原始光譜圖存在嚴(yán)重的光譜疊加現(xiàn)象，許多吸收峰的吸收強(qiáng)度較弱，可能存在潛在的噪音和基線漂移干擾［26］，導(dǎo)致有效的光譜信息被掩蓋，難以準(zhǔn)確提取。本文選擇SG、SNV、1stDec、2ndDec以及兩兩結(jié)合等方法對(duì)樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果如圖2所示。

以R2（包括校正集相關(guān)系數(shù)R2c和預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)R2p）、交叉驗(yàn)證集均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測(cè)集均方根誤差（RMSEP）評(píng)價(jià)模型性能。R2c和R2p越接近1，則預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間的關(guān)聯(lián)越強(qiáng)，預(yù)測(cè)結(jié)果越可靠；R2值大于0.9，則表示模型預(yù)測(cè)值與目標(biāo)變量之間的相關(guān)性較強(qiáng)，可以很好地解釋目標(biāo)變量的方差；RMSECV 越小則定量模型效果越好；RMSEP 越小則模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)［27］。表2 中列出了經(jīng)不同方法預(yù)處理后的定量模型結(jié)果。由表2 可見，對(duì)光譜進(jìn)行導(dǎo)數(shù)處理后，模型質(zhì)量下降，預(yù)測(cè)能力降低。這可能是由于導(dǎo)數(shù)處理放大了噪聲信號(hào)所致。SG 平滑+SNV 處理的光譜在定量模型方面表現(xiàn)出良好的效果，具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。但較高的主因子數(shù)（LV）可能對(duì)模型的穩(wěn)定性和可解釋性有負(fù)面影響［28］。因此，需要進(jìn)行變量篩選去除冗余光譜數(shù)據(jù)，簡(jiǎn)化模型，提高模型的魯棒性。

表2 不同預(yù)處理方法的PLS模型分析結(jié)果Table 2 Results of PLS model analysis with different preprocessing methods

2.6.3 變量篩選方法優(yōu)化本研究在SG +SNV 預(yù)處理的基礎(chǔ)上，選擇MCUVE、CARS、RF 3 種方法進(jìn)行變量篩選，模型分析結(jié)果及變量分布如表3 和圖4（圖中紅色的部分表示對(duì)應(yīng)算法篩選出的關(guān)鍵變量）所示。結(jié)果顯示，RF 方法可從1 333 個(gè)變量中篩選出50 個(gè)重要變量，模型提升結(jié)果為R2c=0.96，RMSEC=0.74；R2p=0.96，RMSEP=0.28。模型性能良好。

表3 不同變量篩選方法的PLS模型分析結(jié)果Table 3 Results of PLS model analysis with different variable screening methods

圖4 清蒸何首烏樣品不同變量篩選后的結(jié)果Fig.4 Results of steamed Polygoni Multiflori samples after different variable selection methods

通過對(duì)66 批何首烏的原始近紅外光譜圖進(jìn)行SG+SNV 處理（圖2H），發(fā)現(xiàn)在9 000～8 000 cm-1波段，何首烏樣品在炮制過程中與生品和制品之間存在較大差異。使用RF 算法篩選出的變量分布在12 000～10 000 cm-1范圍，其中包括O—H 伸縮振動(dòng)以及C—H 伸縮振動(dòng)。同時(shí)，篩選出4 500～4 100 cm-1、6 000～5 500 cm-1和8 000 cm-1附近的變量。其中4 500～4 100 cm-1范圍內(nèi)的波長(zhǎng)點(diǎn)主要由C—H 彎曲振動(dòng)和C—H 伸縮振動(dòng)的合頻以及C—H 彎曲振動(dòng)和O—H 伸縮振動(dòng)的合頻產(chǎn)生［29］；6 000～5 500 cm-1和8 000 cm-1附近的波長(zhǎng)點(diǎn)，由—CH2和—CH3中C—H 伸縮振動(dòng)的第一和第二合頻引起［30］。RF 所選定的波長(zhǎng)點(diǎn)相對(duì)較分散，表明樣品的成分非常復(fù)雜，每個(gè)波段都含有有用信息。然而，要準(zhǔn)確地將這些波段分配給特定的成分難度較高。因此，本研究中只列出了粗略的波段分配，詳細(xì)的波段分配仍需要進(jìn)一步研究。綜上所述，RF算法所篩選出的特征變量準(zhǔn)確、合理，說明這些特征變量與目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。2.6.4 模型驗(yàn)證 將K-S算法劃分的22個(gè)預(yù)測(cè)集樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入建立的RF-PLS模型中，得到模型預(yù)測(cè)值并驗(yàn)證該模型的預(yù)測(cè)能力。表4 為清蒸何首烏多糖含量模型預(yù)測(cè)集實(shí)際值和預(yù)測(cè)值的詳細(xì)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，近紅外光譜預(yù)測(cè)值與實(shí)際值基本一致，相對(duì)偏差均小于3.0%，表明模型的預(yù)測(cè)性能較好，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未知樣本的多糖含量。

表4 預(yù)測(cè)集多糖含量的參考值與預(yù)測(cè)值Table 4 Reference and predicted values of polysaccharide content in prediction set /%

（續(xù)表4）

3 結(jié) 論

中藥質(zhì)量是影響中藥臨床療效、產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大關(guān)鍵問題［31］。中藥的質(zhì)量控制應(yīng)著重注意生產(chǎn)過程中的監(jiān)控，尤其是在線實(shí)時(shí)分析。近紅外光譜技術(shù)作為一種綠色的快速分析方法，可以便捷、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、無(wú)損的分析中藥炮制過程中成分的含量變化。本研究探討了清蒸何首烏過程中何首烏多糖的含量變化，并采用近紅外光譜技術(shù)構(gòu)建了其含量的快速測(cè)定方法，為何首烏的炮制過程研究提供了技術(shù)支持。