賀蘭山主要建群樹種根際土壤真菌群落結構分析

關鍵詞：建群樹種； 真菌多樣性； 群落結構； 土壤理化性質； Illumina MiSeq測序

中圖分類號：S714. 5 文獻標識碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2024. 06. 003

0引言

土壤微生物在土壤有機質的分解、營養物質的循環以及生態系統生產力等眾多生態過程中扮演著至關重要的角色［1-2］。土壤真菌作為土壤微生物群落的重要組成部分，廣泛參與了有機質及其他大分子物質的分解過程［3-4］，在改善和穩定土壤質地與結構、促進土壤養分循環等方面發揮著不可替代的作用［5-7］。尤其值得注意的是，菌根真菌在提升生態系統生產力和增加資源利用效率方面顯示出了其獨特的優勢［8］。因此，土壤真菌對于維持全球多種生態系統功能具有十分關鍵的作用，是土壤健康和肥力的關鍵指標之一［7，9］。

不同森林類型中土壤真菌群落組成和多樣性存在顯著差異。對中國西南地區的針葉林和闊葉林的真菌群落的研究表明，擔子菌門和子囊菌門真菌為優勢類群，柔膜菌目（Helotiales）和阿太菌目（Atheliales） 真菌在針葉林中占主導地位，傘菌目（Agaricales）、紅菇目（Russulales）和革菌目（Thelephorales）真菌在闊葉林中占主導地位［10］。對秦嶺山脈南部的油松（Pinus tabuliformis）根際土壤真菌的研究表明，口蘑屬（Tricholoma）、Meliniomyce、絲蓋傘屬（Inocybe）和革菌科（Thelephoraceae）等是優勢真菌［11］；有研究者報道乳牛肝菌屬（Suillus）、Mallo?cybe、Knufia、青霉屬（Penicillium）和Trechispora 等是油松根際土壤中的主要優勢真菌類群［12］。

土壤真菌群落組成受多種生物和非生物因素的影響。在全球尺度上對土壤真菌的地理分布研究表明，氣候和土壤因子是預測真菌多樣性和組成的最佳參數，但不同真菌類群隨著氣候、土壤、植物參數變化的模式表現出了很大的差異［13］。Tedersoo等［14］對芬蘭和愛沙尼亞的森林生態系統中真菌群落的研究表明，土壤真菌多樣性受土壤pH、養分、樹種種植面積和植被覆蓋的影響，土壤環境和空間結構是真菌群落組成的關鍵因素。研究發現全球范圍內的外生菌根真菌分布相對均勻，但區域間存在差異，外生菌根真菌多樣性與土壤鈣質量濃度、溫度和降水等因素有密切關系［15-16］。Duan等［17］研究表明，生物結皮和灌木覆蓋通過調節土壤pH、C∶N和C∶P改變了土壤真菌群路的組成。Wang等［12］研究表明，土壤pH、含水量和樹齡等都會影響油松根際土壤中的真菌多樣性。以上研究結果表明，土壤真菌的群落構建除受寄主植物的影響，還受當地的環境條件如氣候、土壤、地理及樹種等的顯著影響。

賀蘭山位于我國西北地區，屬于半干旱區向干旱區的過渡地帶，具有溫帶干旱半干旱山地森林的典型特點。青海云杉（Picea crassifolia）、油松和白樺（Betula platyphylla）是賀蘭山的主要建群樹種，在涵養水源、保持水土以及維持生態平衡中發揮了重要作用。土壤真菌作為森林生態系統的重要組成部分，其多樣性和群落結構直接影響著整個森林生態系統的功能和穩定性。系統分析賀蘭山地區土壤真菌群落的組成特點，對明確我國西北干旱半干旱地區森林生態系統中土壤真菌群落的功能具有重要意義。因此，本研究基于高通量測序技術，對內蒙古賀蘭山國家級自然保護區的主要建群樹種青海云杉、油松和白樺的根際土壤真菌多樣性及群落結構進行了研究。

1材料與方法

1. 1研究區概況

采樣地位于內蒙古賀蘭山國家級自然保護區（38°36′～38°40′N，105°25′～105°28′E），地處內蒙古自治區阿拉善左旗境內，屬于典型的大陸性氣候。保護區年平均氣溫3.1 ℃，年平均降水量269～300 mm。分別在青海云杉、油松和白樺的集中分布區內隨機設立了3個100m×100m的重復樣地，共9個樣地，樣地間隔150m，郁閉度0. 6～0. 7。青海云杉主要分布在海拔2200～2300m 的山脊和陽坡，坡度平均22°，平均胸徑24cm，平均樹高達到30m；油松多生長在海拔2000～2100m的陰坡和半陰坡，平均坡度8°，胸徑平均22cm，平均樹高26m；白樺多分布于海拔1900～2100m的溝谷和半陰坡，平均坡度16°，平均胸徑17cm，平均樹高21m。

1. 3采樣方法

在每個樣地內，按照S形隨機布點法選取健康植株，每種樹各10棵。先用鏟子輕輕除去地表的落葉、雜草等雜物，沿著樹的根部輕輕拽到根的末端，收集土壤。將每種林分3個重復樣地的根際土混合，放入低溫冰盒中保存，迅速帶回試驗室。將土樣在2 mm土壤篩中過篩后分成兩份，一份置于-80 ℃保存，用于高通量測序；另一份用于土壤理化性質的檢測。

1. 4土壤理化性質測定

本研究測定了土壤碳含量（soil carbon content，SCC）、全氮含量（total nitrogen，TN）、含水量（soilwater content，SWC）、速效鉀（available potassium，AK）、有效磷（available phosphorus，AP）及土壤pH。測定參考鮑士旦的方法進行［18］。

1. 5土壤真菌總DNA提取、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增及測序

采用試劑盒提取土壤總DNA，并通過0. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。PCR則采用了NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶進行擴增，而回收產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并切膠回收。選用特異性引物ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進行擴增。PCR擴增產物后續試驗均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。使用Illumina‐Miseq平臺測序對優化后的序列進行操作分類單位（operational" taxonomic units，OTU）的劃分。將相似性97%的序列進行聚類，將豐度值低于全體樣本測序總量0. 001%的OTU去除，將去除了稀有OTU的豐度矩陣用于后續的系列分析。參考UNITE數據庫對OTU 進行分類單元名稱指定（Release 5. 0，https：//unite. ut. ee/）。

1. 6生物信息學分析

使用QIIME軟件計算樣品的ACE（abundancbasedcoverage estimator）豐富度估計指數、Chao1豐富度估計指數、香農指數（Shannon index）及辛普森指數（Simpson index）。使用SPSS 26. 0 軟件對土壤真菌豐度及土壤理化性質進行相關性分析及顯著性檢驗運用R（4. 2. 3）及Rstudio軟件制作韋恩圖分析各樣地共有或特有的真菌OTU數量，制作箱線圖分析α-多樣性指數。真菌群落的相對豐度及土壤理化性質的Pearson相關性分析及顯著性檢驗使用SPSS 16. 0軟件完成。土壤理化性質對真菌群落組成差異的冗余分析（distance-based redundancy analysis，db-RDA）使用Canoco（version 5. 0）軟件分析。

2結果與分析

2. 1賀蘭山主要建群樹種土壤理化性質分析

對賀蘭山主要建群樹種青海云杉、油松和白樺的土壤理化性質的分析表明（表1），3個樹種的土壤含水量均相對較低，介于5. 87%±0. 13%～18. 19%±5. 61%，與油松（5. 87%±0. 13%）相比，白樺（18. 19%±5. 61%）和青海云杉（14. 14%±6. 20%）土壤的含水量提高了309. 88% 和240. 72%（Plt;0. 05）。3個樹種的土壤pH都在中性偏堿范圍內（7. 15±0. 15～8. 01±0. 02）。3個樹種土壤的碳、氮和磷質量分數均有顯著差異，青海云杉顯著高于油松和白樺；速效鉀質量分數沒有顯著差別，范圍在279. 67～284. 33mg/kg。

2. 2賀蘭山主要建群樹種土壤真菌群落組成

通過Illumina Miseq測序平臺，分別獲得青海云杉、油松和白樺的真菌有效序列64219、59304、55 197條，聚類為1 410個真菌OTUs，如圖1所示。青海云杉、油松和白樺的真菌OTUs數分別為486、667、674個，3個樹種的共有OTUs數為60個。白樺的特有OTUs數最多，為433個；其次是油松，為353個；青海云杉的特有OTUs最少，為267個。以上結果說明樹種對土壤真菌OTUs組成有顯著影響。所有真菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、隱真菌門（Rozellomycota）、纖毛門（Ciliophora）、毛霉門（Mucoromycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）、絲足蟲門（Cercozoa）和Anthophyta共11個門，以及 6個未定門，分屬于42綱、107目、210科、326屬。

2. 3賀蘭山主要建群樹種根際土壤優勢真菌分析

對賀蘭山主要建群樹種根際土壤優勢真菌（屬水平的相對豐度大于等于1%）的分析（表2、圖2）表明，所有真菌隸屬于擔子菌門、子囊菌門和1個未定門。其中擔子菌門真菌的相對豐度最高，為58. 7%；其次為子囊菌門真菌，為35. 7%。

擔子菌門中鑒定到綱水平的有2個，分別為傘菌綱（Agaricomycetes，54. 4%）和雙子囊菌綱（Geminibasidiomycetes，3. 7%）。在目水平上，相對豐度較高的有革菌目（20. 6%）、傘菌目（13. 9%）、釘菇目（Gomphales，9. 3%）、蠟殼耳目（Sebacinales，7. 1%）。在科水平上，相對豐度較高的有革菌科（Thelephora‐ceae，20. 6%）、釘菇科（Gomphaceae，9. 3%）、蠟殼耳科（Sebacinaceae，7. 0%）。在屬水平上，相對豐度較高的屬為蠟殼耳屬（6. 7%）、棉革菌屬（6. 5%）、絲蓋傘屬（6. 1%）、雙子囊菌屬（Geminibasidium，3. 7%）、絲膜菌屬（2. 5%）、滑菇屬（Hebeloma，2. 0%）。

子囊菌門中鑒定到綱水平的有7個，分別為子囊菌綱（Eurotiomycetes，7. 4%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，7. 1%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes，5. 6%）、未定綱（4. 1%）、錘舌菌綱（Leotiomycetes，3. 8%）、盤菌綱（Pezizomycetes，3. 6%）和古根菌綱（Archaeorhizomycetes，2. 8%）。在目水平上，相對豐度較高的有刺盾炱目（Chaetothyriales，4. 2%）、盤菌目（Pezizales，3. 6%）、子囊菌目（Eurotiales，2. 9%）、古根菌目（Archaeorhizomycetales，2. 8%）、柔膜菌目（2. 7%）。在科水平上，相對豐度較高的有曲霉菌科（Aspergillaceae，2. 9%）、古根菌科（Archaeorhizomycetaceae，2. 8%）、船殼菌科（Gloniaceae，2. 6%）。在屬水平上，相對豐度較高的有青霉屬（2. 9%）、古根菌屬（Archaeo?rhizomyces，2. 8%）、空團菌屬（Cenococcum，2. 6%）。

進一步分析發現，青海云杉、油松和白樺根際土壤的優勢真菌屬分別有14屬、12屬和17屬。除未定屬以外，相對豐度最高的5個屬分別為蠟殼耳屬（6. 7%）、棉革菌屬（6. 5%）、絲蓋傘屬（6. 1%）、雙子囊菌屬（3. 7%）和青霉屬（2. 9%）。雙子囊菌屬是白樺根際土壤中相對豐度最高的屬，占所有優勢真菌的10. 8%；青海云杉根際土壤中相對豐度最高的屬為蠟殼耳屬和棉革菌屬，分別占所有優勢真菌的9. 0%和7. 0%；絲蓋傘屬和棉革菌屬為油松根際土壤中相對豐度最高的屬，占所有優勢真菌的16. 9%和11. 7%。另外，白樺（19. 3%）根際土壤中擔子菌門真菌的相對豐度顯著低于青海云杉（76. 0%）和油松（81. 0%），而子囊菌門真菌的相對豐度（67. 5%）則顯著高于青海云杉（21. 3%）和油松（18. 2%）。以上研究結果顯示，樹種在真菌群落構建中起到了重要作用。

2. 4賀蘭山主要建群樹種根際土壤真菌群落的α多樣性指數分析

對賀蘭山主要建群樹種青海云杉、油松和白樺根際土壤真菌群落的α多樣性指數的分析表明（圖3），3個樹種根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性均有顯著差異。對真菌群落的Chao1指數和Ace指數的分析表明，3個樹種根際土壤真菌群落的豐富度沒有顯著差異；對真菌群落的Simpson 指數和Shannon指數的分析表明，白樺根際土壤真菌群落的多樣性最高，其次為油松，青海云杉最低。

2. 5土壤理化因子對賀蘭山主要建群樹種根際土壤真菌群落組成的影響

對土壤理化因子之間的相關性分析表明（表3），pH與土壤碳含量、有效磷、全氮均呈極顯著負相關；土壤碳含量與全氮含量、有效磷均呈極顯著正相關；全氮含量和有效磷呈極顯著正相關。

采用冗余分析（RDA）法分析了土壤理化因子對賀蘭山主要建群樹種青海云杉、油松和白樺根際土壤真菌群落組成的影響（表4，圖4）。結果表明，所有因子共解釋了土壤真菌群落變異的94. 4%，其中全氮和土壤含水量對真菌群落組成均有顯著影響，解釋度分別為41. 6%和39. 1%；pH、有效磷、速效鉀和碳含量對土壤真菌的群落組成無顯著影響。pH與古根菌屬、絲膜菌屬、球肉盤菌屬、革菌屬、齒菌屬、傘菌屬的相對豐度呈極顯著負相關；土壤碳含量、有效磷和全氮含量則與上述優勢真菌的相對豐度呈顯著或極顯著正相關。土壤含水量與棉革菌屬、絲蓋傘屬、空團菌屬、滑菇屬、乳牛肝菌屬、口蘑屬的相對豐度呈顯著或極顯著負相關。

3討 論

3. 1賀蘭山主要建群樹種根際土壤真菌群落組成

本研究結果表明，賀蘭山主要建群樹種青海云杉、油松和白樺根際土壤的優勢真菌為擔子菌門（相對豐度58. 7%）和子囊菌門（相對豐度35. 7%）真菌，占所有土壤真菌相對豐度的94. 4%。共獲得1410個真菌OTUs，分屬于17門、42綱、107目、210科、326屬，表明該環境中有豐富的真菌群落，真菌群落在改善土壤環境等方面發揮著重要作用，對于維持森林生態系統的穩定具有重要意義［19］。擔子菌門真菌分解木材組分的能力強，菌絲體傳播能力強，孢子可完成長距離擴散和初代菌群的建立，因此成為土壤真菌中的優勢菌群［20］。子囊菌門真菌的適應性強，可在高鹽度（如鹽湖地區）、低光線（如洞穴中）、低營養和有機物質（如巖石上）等極端環境生存，在全球范圍廣泛分布［21-22］。因此，賀蘭山主要建群樹種根際豐富的真菌群落對于維持當地森林生態系統的健康可持續發展具有重要意義。

本研究中，優勢真菌屬共有24個，其中12屬為外生菌根真菌，據報道這些真菌可與青海云杉、油松和白樺形成外生菌根［23-24］。外生菌根真菌與樹木共生后，相互之間能形成一個營養交換的菌根網絡系統［25-26］，可以增加寄主植物對氮、磷和鉀等營養元素的吸收，并增強植物的抗病、抗寒、抗鹽及抗重金屬等對極端環境的適應能力［3，27-28］；同時寄主植物提供給外生菌根真菌光合產物等物質以供其生長［29］，二者互利共生。外生菌根真菌與寄主植物的相互作用在整個陸生植物進化過程中扮演了重要角色，強烈影響著森林生態系統的功能［30-31］。因此，賀蘭山主要建群樹種與多種外生菌根真菌共生，在促進寄主植物健康生長及增強寄主植物抗逆性方面發揮了重要作用。

本研究分析了青海云杉、油松和白樺的共有及特有真菌OTUs的相對豐度占比（圖1），發現白樺根際土壤真菌的多樣性顯著高于青海云杉和油松（圖3），子囊菌門真菌更偏好于白樺，擔子菌門真菌更偏好于青海云杉和油松（表3），表明寄主植物在真菌群落構建中發揮了重要作用［32］。Gao等［33］在人工混交林土壤微生物群落與土壤理化性質之間關系的研究中也發現，樹種是影響真菌群落最重要的因子。Wang等［34］也認為，外生菌根真菌的多樣性因寄主植物種類或寄主植物發育階段不同而不同，不同的外生菌根真菌對于不同的植物有一定的偏好性。

3. 2土壤理化因子對賀蘭山主要建群樹種土壤真菌群落結構的影響

除寄主植物外，土壤微生物的群落構建與土壤pH、有機碳、全氮和土壤含水量等理化性質密切相關［35］。本研究結果也表明，全氮含量和土壤含水量對賀蘭山主要建群樹種青海云杉、油松和白樺根際土壤真菌的群落組成有顯著影響（表4）。大量研究表明，土壤含氮量可影響植物的生產力、穩定性和群落結構，從而導致土壤微生物群落結構發生改變［36-37］。本研究中，土壤含氮量與古根菌屬、絲膜菌屬、球肉盤菌屬、革菌屬、齒菌屬和傘菌屬等真菌的相對豐度呈顯著正相關關系（圖4）。Zhao等［38］研究表明土壤氮水平是影響真菌群落和功能的關鍵因素。Wang等［12］的研究中發現土壤氮含量與真菌多樣性呈顯著負相關關系，原因可能是氮的累積會造成土壤pH下降與微生物碳源流失［39-40］，改變了土壤養分狀況［41］，最終導致微生物多樣性降低［42］；也有可能是過量的氮素輸入會抑制特定微生物的活性，甚至產生毒性，導致真菌多樣性下降［43］。

土壤含水量是影響土壤真菌群落組成的另一重要因子［44］。研究表明，土壤含水量能控制微生物生理學反應，尤其是微生物的呼吸和生長，低含水量可能會導致微生物受到缺水脅迫而休眠或產生脅迫代謝物，而高含水量會影響土壤氧氣的擴散率與可用性，抑制微生物的活動和呼吸作用［45］。對白云杉（P. glauca）和北美短葉松（P. banksiana）土壤真菌群落的研究表明，土壤含水量能夠通過間接影響土壤鹽質量濃度等因素而導致真菌群落結構發生改變［46］。李丹丹等［47］在對科爾沁沙地樟子松人工林土壤真菌群落結構特征的研究中發現，土壤含水量是影響土壤真菌群落組成的重要因素。本研究中土壤含水量與棉革菌屬、絲蓋傘屬、空團菌屬、滑菇屬、乳牛肝菌屬、口蘑屬呈極顯著或顯著負相關關系（圖4），這些外生菌根真菌與植物共生后，能夠幫助植物更有效地吸收水分和養分，提高植物在干旱脅迫下的存活率［48］。

4結論

賀蘭山主要建群樹種的根際土壤真菌多樣性水平較高。其中，白樺根際土壤中真菌的OTUs數量最多，油松次之，青海云杉最少。與白樺相比，油松和青海云杉的真菌OTUs數量分別減少了1. 0%和27. 9%。土壤全氮含量和土壤含水量在真菌群落構建中起到了重要作用。研究結果可以豐富賀蘭山土壤真菌資源的生物信息，也可為干旱半干旱地區森林生態系統中真菌資源的可持續利用提供科學依據。未來應該進一步探索不同環境壓力下真菌群落的適應性和功能演變，以及真菌與植物間相互作用的分子機制，以促進生態系統恢復和生物多樣性保護。