基于化學(xué)模式識別結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法的鮮地黃藥材質(zhì)量評價△

徐杰，姚曉璇，黃夢婷，黃瑤，潘玲，張正*

1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；

2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

鮮地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根，秋季釆挖，除去蘆頭、須根及泥沙，具有清熱生津、涼血止血的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，鮮地黃在治療上中焦溫熱病、消炎、抗菌、止血等方面療效顯著[2-3]，其現(xiàn)代化制劑也越來越受到重視[4-5]。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版對鮮地黃僅進行了性狀、鑒別項的要求，因此需要建立科學(xué)的鮮地黃質(zhì)量綜合評價體系。

灰色關(guān)聯(lián)度分析是根據(jù)曲線間相似程度判斷因素間的關(guān)聯(lián)程度，可以為系統(tǒng)的發(fā)展變化態(tài)勢提供量化的度量，基于“中藥成分與中藥質(zhì)量是一種灰色關(guān)系”的認識，可以運用該方法評價藥材質(zhì)量[6]。近年來，灰色關(guān)聯(lián)度法已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量綜合評價領(lǐng)域[7-9]。本研究采集了河南、山西、河北的32 批鮮地黃藥材，測定各批樣品的總灰分、酸不溶性灰分、浸出物，以及梓醇、地黃苷D、鉛、鎘、砷、汞、銅含量，建立指紋圖譜，通過化學(xué)模式識別結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法對不同產(chǎn)地鮮地黃進行綜合質(zhì)量評價，以期為鮮地黃藥材質(zhì)量評價與控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Arc 型高效液相色譜儀、ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Thermo ICAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ME204E型分析天平、XP26型分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機（德國Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品梓醇（批號：110808-201711，純度：99.6%，中國食品藥品檢定研究院）；地黃苷D（批號：ST11190120，純度：98.0%，上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司）；益母草苷（批號：17122601，純度：99.6%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；色譜級甲醇、乙腈（德國默克股份有限公司）；色譜級磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為實驗室自制超純水。

32 批鮮地黃藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根，樣品信息見表1。

表1 32批鮮地黃藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 灰分測定

按《中國藥典》2020 年版通則2302 灰分測定法[10]，測定32 批鮮地黃藥材樣品的總灰分和酸不溶性灰分，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，以干燥品計，32批鮮地黃藥材總灰分為1.5%～4.2%，均小于8%；32批鮮地黃藥材酸不溶性灰分為0.1%～0.3%，均小于3%，表明收集的32 批鮮地黃藥材均符合《中國藥典》2020 年版地黃項下總灰分和酸不溶性灰分的限量要求。

表2 32批鮮地黃藥材各指標測定結(jié)果

2.2 浸出物測定

按《中國藥典》2020 年版通則2201 浸出物測定法第一法[10]，測定32 批鮮地黃藥材水溶性浸出物，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，以干燥品計，32 批鮮地黃浸出物質(zhì)量分數(shù)為84.7%～92.3%，均超過65%，符合《中國藥典》2020 年版地黃項下浸出物的限量要求。

2.3 重金屬及有害元素測定

按《中國藥典》2020 年版通則2321 原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]，測定32 批鮮地黃藥材的重金屬及有害元素，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，32 批鮮地黃中鉛、鎘、砷、汞、銅的含量均符合《中國藥典》2020 年版對重金屬及有害元素的一般限量要求。

2.4 梓醇含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 取鮮地黃藥材樣品適量，切碎，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品適量，加流動相溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為500.988 μg·mL-1的溶液，即得。

2.4.3 色譜條件 采用ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶99）為流動相；檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。鮮地黃藥材供試品溶液及梓醇對照品溶液的色譜圖見圖1。采用信噪比法計算梓醇的檢測限為0.59 μg·mL-1，定量限為1.96 μg·mL-1。

圖1 梓醇對照品和鮮地黃藥材樣品的HPLC圖

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.4.2 項下梓醇對照品溶液，分別加流動相稀釋5、10、25、50 倍，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的梓醇對照品溶液。精密吸取上述不同質(zhì)量濃度的梓醇對照品溶液10 μL，按

2.4.3 項下色譜條件進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為Y=2331X-4 895.4（r=1），表明梓醇質(zhì)量濃度為10.020～500.988 μg·mL-1時與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，按2.4.3項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，6 次測定結(jié)果的RSD為0.29%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，分別在0、2、4、6、8、16、24 h，按2.4.3 項下色譜條件進樣測定，記錄梓醇峰面積，24 h 內(nèi)供試品中梓醇峰面積的RSD為2.54%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗 分別取鮮地黃藥材供試品（S1）6 份，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下色譜條件進樣測定，計算6 份供試品中梓醇含量的RSD為0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知梓醇含量的鮮地黃藥材供試品（S1）9 份，每份約1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入梓醇對照品，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下色譜條件進樣測定，梓醇的加樣回收率為100.87%，RSD為3.33%，表明該方法準確度良好。

2.4.9 梓醇含量測定 取32 批鮮地黃藥材樣品，分別按2.4.1項下方法制備供試品溶液，按2.4.3項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，32批鮮地黃藥材梓醇質(zhì)量分數(shù)為2.768%～5.876%，均值為4.090%，RSD為19.77%。

2.5 地黃苷D含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備 取鮮地黃藥材樣品適量，切碎，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取地黃苷D 對照品適量，加流動相溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為115.248 μg·mL-1的溶液，即得。

2.5.3 色譜條件 采用ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95）為流動相；檢測波長為203 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。鮮地黃藥材供試品溶液及地黃苷D 對照品溶液的色譜圖見圖2。采用信噪比法計算地黃苷D的檢測限為0.17 μg·mL-1，定量限為0.58 μg·mL-1。

圖2 地黃苷D對照品和鮮地黃藥材樣品的HPLC圖

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取地黃苷D 對照品溶液適量，分別加流動相稀釋4、10、25、50 倍，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的地黃苷D 對照品溶液。精密吸取上述不同質(zhì)量濃度的地黃苷D 對照品溶液10 μL，按2.5.3 項下色譜條件進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程為Y=5 563.7X-809.94（r=1），表明在地黃苷D質(zhì)量濃度為2.305～115.248 μg·mL-1時與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.5 精密度試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，按2.5.3 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄地黃苷D 的峰面積，6 次測定結(jié)果的RSD為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，分別在0、2、4、6、8、16、24 h 進樣，按2.5.3 項下色譜條件進樣測定，記錄地黃苷D 峰面積，24 h內(nèi)樣品中地黃苷D峰面積的RSD為1.48%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）6份，按2.5.1項下方法制備供試品溶液，按2.5.3項下色譜條件進樣測定，6 份供試品地黃苷D 含量的RSD為0.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）9份，每份約1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入地黃苷D 對照品，按2.5.1項下方法制備供試品溶液，按2.5.3項下色譜條件進樣測定，地黃苷D的加樣回收率為98.11%，RSD為2.97%，表明該方法的準確度良好。

2.5.9 地黃苷D 含量測定 取32 批鮮地黃藥材樣品，分別按2.5.1 項下方法制備供試品溶液，按2.5.3 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，32 批鮮地黃藥材地黃苷D 質(zhì)量分數(shù)為0.164%～0.432%，均值為0.288%，RSD為19.75%。

2.6 鮮地黃藥材指紋圖譜的建立

2.6.1 供試品溶液的制備 取鮮地黃藥材樣品（S1）適量，切碎，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣用0.1%磷酸水溶液溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加0.1%磷酸水溶液定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品梓醇、地黃苷D、益母草苷適量，加0.1%磷酸水溶液溶解并定容，制成混合對照品溶液。

2.6.3 色譜條件 Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，100%B；5～7 min，100%～95%B；7～10 min，95%B；10～16 min，95%～89%B；16～18 min，89%～84%B；18～35 min，84%～70%B）；檢測波長為203 nm；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

2.6.4 方法學(xué)考察

2.6.4.1 精密度試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，按2.6.3 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以地黃苷D 相應(yīng)的峰（4 號峰）為S 峰，計算各色譜峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0～0.29%、0.35%～0.94%，表明儀器精密度良好。

2.6.4.2 穩(wěn)定性試驗 取鮮地黃藥材供試品（S1）溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算24 h 內(nèi)供試品溶液各色譜峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0～1.87%、0.51%～2.94%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4.3 重復(fù)性試驗 取鮮地黃藥材樣品（S1）6份，按2.6.1項下方法制備供試品溶液，按2.6.3項下色譜條件進樣測定，計算6 份供試品中各色譜峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0～0.95%、1.27%～3.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 指紋圖譜的建立及色譜峰指認 取32 批鮮地黃藥材樣品，按2.6.1 項下方法制備供試品溶液，按2.6.3 項下色譜條件進樣檢測，記錄各特征峰峰面積值并進行量化處理（峰面積/稱樣量），結(jié)果見表3。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）對采集的色譜信息進行數(shù)據(jù)處理，生成鮮地黃藥材對照指紋圖譜，并確立了10 個共有峰，見圖3。通過對照品比對，指認了其中3個成分，分別為梓醇、地黃苷D、益母草苷，結(jié)果見圖4。

圖3 32批鮮地黃藥材UPLC指紋圖譜

圖4 鮮地黃藥材樣品及混合對照品溶液的色譜圖

表3 32批鮮地黃藥材各特征峰峰面積/稱樣量

2.6.6 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）計算32 批鮮地黃藥材指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示，32 批鮮地黃藥材的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.995，說明各產(chǎn)地鮮地黃藥材指紋圖譜差異不明顯。

2.7 不同產(chǎn)地鮮地黃藥材多指標成分的聚類分析（HCA）

將32 批鮮地黃藥材的總灰分，酸不溶性灰分，浸出物、重金屬及有害元素、梓醇、地黃苷D 質(zhì)量分數(shù)及10 個特征峰的峰面積值作為變量，形成數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件，以離均差平方和法為聚類方法、歐氏距離平方法為測量距離方法，進行HCA。聚類結(jié)果見圖5，當距離為15 時，32 批鮮地黃藥材可分為4 類。S2、S4～S6、S9、S14、S16、S20、S26～S32 聚為一類，S7、S10、S11、S13、S19、S21 聚為一類，S1、S12、S22 聚為一類，S3、S8、S15、S17、S18、S23～S25聚為一類?？傮w上未見明顯的產(chǎn)地分類聚集現(xiàn)象，河南、河北、山西的鮮地黃藥材整體質(zhì)量較為接近。

圖5 32批鮮地黃HCA

2.8 不同產(chǎn)地鮮地黃藥材多指標成分的主成分分析（PCA）

將32 批鮮地黃藥材的總灰分，酸不溶性灰分，浸出物、重金屬及有害元素、梓醇、地黃苷D 的質(zhì)量分數(shù)及10 個特征峰的峰面積值作為變量，采用SIMCA 14.1 軟件對32 批鮮地黃藥材進行PCA，以特征值＞1為評判標準，共提取7 個主成分，累積方差貢獻率為80.6%。提取方差貢獻率最高的主成分PC1、PC2 繪制得分散點圖，見圖6。結(jié)果顯示，32批鮮地黃藥材聚類結(jié)果與2.7 項下HCA 結(jié)果基本一致。

圖6 32批鮮地黃PCA得分

2.9 不同產(chǎn)地鮮地黃藥材多指標成分的正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

將32 批鮮地黃藥材的總灰分，酸不溶性灰分，浸出物、重金屬及有害元素、梓醇、地黃苷D 的質(zhì)量分數(shù)及10 個特征峰的峰面積值作為變量，采用SIMCA 14.1軟件對32批鮮地黃藥材進行OPLS-DA，得分圖見圖7。分析OPLS-DA 模型中的變量重要性投影（VIP），結(jié)果見圖8。對不同產(chǎn)區(qū)的鮮地黃藥材各指標的VIP 值進行排列，選擇VIP 值＞1 的指標作為區(qū)分不同產(chǎn)地鮮地黃藥材的主要差異性成分。結(jié)果顯示，峰3（VIP 值為1.540）、峰2（VIP 值為1.533）、峰1（VIP值為1.366）、梓醇質(zhì)量分數(shù)（VIP值為1.298）、浸出物質(zhì)量分數(shù)（VIP值為1.248）、峰10（VIP值為1.216）、總灰分（VIP值為1.203）、峰9（VIP值為1.183）均大于1，說明以上指標對不同產(chǎn)地鮮地黃藥材的分類影響較大，而其他指標對鮮地黃藥材產(chǎn)地的區(qū)分影響較小。

圖7 32批鮮地黃OPLS-DA

圖8 32批鮮地黃VIP分析（±s,n=32）

2.10 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.1 0.1 無量綱化處理 以32 批鮮地黃藥材的總灰分，酸不溶性灰分，浸出物、梓醇、地黃苷D、鉛、鎘、砷、汞、銅的質(zhì)量分數(shù)及指紋圖譜10 個共有峰的峰面積值作為鮮地黃藥材質(zhì)量綜合評價指標，按公式（1）采用均值法建立矩陣并進行無量綱化處理，結(jié)果見表4。

式中，i為待評樣本數(shù)（i=0，1，2，3……m），k為評價指標數(shù)（k=1，2，3……n），在本研究中，m=32，n=20。

2.1 0.2 關(guān)聯(lián)系數(shù)的確定 比較數(shù)列值與相對應(yīng)的參考數(shù)列值差的絕對值，按公式（2）計算各指標的關(guān)聯(lián)系數(shù)，ρ的取值通常為0.5，關(guān)聯(lián)系數(shù)反映了待評指標與該指標理想值的吻合程度，越大說明越接近該指標的理想值，結(jié)果見表5。

表5 32批鮮地黃參評材料各質(zhì)量指標的關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.1 0.3 關(guān)聯(lián)度和權(quán)重的確定 按公式（3）、公式（4）計算各指標的關(guān)聯(lián)度和權(quán)重，總灰分，酸不溶性灰分，浸出物、梓醇、地黃苷D、鉛、鎘、砷、汞、銅的質(zhì)量分數(shù)，峰1～10 的峰面積值關(guān)聯(lián)度分別為0.79、0.85、0.98、0.80、0.78、0.72、0.77、0.72、1.00、0.74、0.75、0.44、0.84、0.80、0.72、0.67、0.69、0.79、0.53、0.65，權(quán)重分別為0.05、0.06、0.06、0.05、0.05、0.05、0.05、0.05、0.07、0.05、0.05、0.03、0.06、0.05、0.05、0.04、0.05、0.05、0.03、0.04。

式中，r（k）為關(guān)聯(lián)度，ω（k）為權(quán)重。

2.1 0.4 灰色綜合評價值的確定 按公式（5）計算灰色關(guān)聯(lián)度并對所得值大小進行排序，結(jié)果見表6。32 批鮮地黃藥材灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明，關(guān)聯(lián)度排 序為S10＞S21＞S11＞S30＞S32＞S6＞S2＞S16＞S27＞S4＞S1＞S28＞S19＞S29＞S18＞S20＞S9＞S5＞S8＞S7＞S22＞S23＞S31＞S13＞S3＞S26＞S15＞S17＞S24＞S25＞S12＞S14。河南產(chǎn)鮮地黃藥材綜合質(zhì)量排名比較分散，最優(yōu)的批次為S10，產(chǎn)自河南省焦作市武陟縣；河北產(chǎn)的3 批鮮地黃藥材有2 批分別排名第4、第5；山西產(chǎn)的3 批鮮地黃藥材排名比較接近，排名第9、第12、第14。關(guān)聯(lián)度為0.036～0.042，關(guān)聯(lián)度差異為0～13.89%，說明32 批鮮地黃藥材總體質(zhì)量差異并不大，這與HCA 和PCA 的結(jié)果一致。

表6 32批鮮地黃參評材料的灰色關(guān)聯(lián)度、排名及關(guān)聯(lián)度差異

式中，r′（i）為灰色關(guān)聯(lián)度。

3 討論

《中國藥典》2020 年版地黃項下規(guī)定了生地黃梓醇和地黃苷D 的含量限度，考慮鮮地黃的水分含量遠高于生地黃，故本研究在《中國藥典》2020 年版的基礎(chǔ)上考察了不同提取溶劑、提取方式、提取時間及溶劑用量對鮮地黃梓醇和地黃苷D 提取效率的影響。結(jié)果表明，采用60%甲醇回流提取1.5 h，鮮地黃藥材梓醇的提取效率最高；采用60%甲醇超聲處理0.5 h，鮮地黃藥材地黃苷D的提取效率最高。

本研究建立了鮮地黃藥材UPLC指紋圖譜，標定了10 個共有峰，并對梓醇、地黃苷D 和益母草苷色譜峰進行了指認。研究表明，梓醇為地黃環(huán)烯醚萜苷類成分，是發(fā)揮降血糖生物活性的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[11]，可以調(diào)節(jié)脂肪細胞的糖脂代謝（通過活化位于腎上腺髓質(zhì)的腎上腺受體、促進β-內(nèi)啡肽釋放、提高葡萄糖運轉(zhuǎn)蛋白-4 的表達）從而提高葡萄糖轉(zhuǎn)運率、增加葡萄糖利用率、抑制糖異生、降低鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，地黃苷D 可能是地黃發(fā)揮抗抑郁作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，該成分可有效緩解由高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12 細胞損傷，其作用機制可能為提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達，并通過BDNF-酪氨酸激酶受體B（TrkB）通路發(fā)揮抗凋亡作用，最終保護神經(jīng)細胞，發(fā)揮抗抑郁作用[14-15]。此外，地黃中的益母草苷可有效抑制食管癌細胞的增殖，細胞凋亡明顯且細胞周期出現(xiàn)G2/M 期阻滯[16]。可見，本研究構(gòu)建的指紋圖譜可表征鮮地黃的主要活性成分，能為鮮地黃藥材及其制劑的整體質(zhì)量評價提供參考。OPLS-DA結(jié)果表明，指紋圖譜中峰1～3、9、10 的峰面積均為影響各產(chǎn)地鮮地黃藥材質(zhì)量差異的主要因素，根據(jù)已指認的成分（峰3、峰4、峰6）初步判斷上述色譜峰表征的可能為環(huán)烯醚萜苷類成分，是地黃的主要活性成分，后續(xù)研究需對以上共有峰進行進一步歸屬。

HCA 結(jié)果表明，32 批鮮地黃藥材聚為4 類，但未見明顯的產(chǎn)地聚集現(xiàn)象。分析原因為本研究收集的32 批鮮地黃藥材產(chǎn)地較為集中，基本處在河南、河北、山西的交界處，經(jīng)緯度相差不大，且均為人工種植，因此質(zhì)量較為接近。由于采樣、保鮮、運輸、儲藏條件的限制，本研究收集的鮮地黃藥材樣品未能覆蓋大部分主產(chǎn)區(qū)，同時本研究建立的鮮地黃藥材特征圖譜主要表征的是鮮地黃藥材中極性較大的環(huán)烯醚萜苷類成分，對于地黃中另一類活性成分苯乙醇苷類成分并未能有效表征，因此關(guān)于不同產(chǎn)地鮮地黃藥材質(zhì)量優(yōu)劣評價的結(jié)果是否具有更廣泛的代表性，還需要后續(xù)進一步擴大樣本量進行系統(tǒng)深入的研究。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。