菊花中216種農藥殘留檢測分析△

李海亮，劉芫汐，王趙，昝珂，王瑩，金紅宇，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有平肝明目、清熱解毒等功效，常用于風熱感冒、瘡癰腫毒、頭痛眩暈、眼目昏花、目赤腫痛等[1]，含有黃酮、氨基酸、綠原酸、揮發油及微量元素等類成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[2-5]。菊花在我國藥用和栽培歷史悠久，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）規定，菊花按產地和加工方法的不同，分為滁菊、亳菊、杭菊、貢菊和懷菊[1]。菊花種植區主要分布于安徽、浙江、河南、江蘇等省，其中安徽黃山、浙江桐鄉、江蘇射陽、河南焦作等地種植較多；其種植過程中濫用農藥問題較為嚴重，農藥殘留風險較大，嚴重影響菊花的質量和用藥安全[6]。因此，有必要對菊花中的農藥殘留進行監測，進一步開展菊花中農藥殘留的風險評估，為制定合理的菊花農藥殘留標準限度提供科學依據。

在種植過程中，菊花常受多種病蟲害的影響，主要病害有葉斑病、葉枯病、灰霉病、病毒病、斑枯病、根腐病、白粉病等，主要蟲害有蚜蟲、斜紋夜蛾、菊潛葉蠅等，種植過程中主要使用有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯等類農藥[7-8]。除禁用農藥殘留外，多菌靈、噻蟲嗪、啶蟲脒、烯酰嗎啉、戊唑醇、百克敏等為菊花中檢出率較高的農藥品種[6]。目前，已有學者建立了菊花中有機氯類、有機磷類、禁用類等農藥的測定方法[9-15]。本課題組通過調查研究結合查閱現行國家農藥名錄，篩選出216 種常用農藥作為檢測指標，借鑒本課題組前期對花類、果實類等中藥中禁用、常用農藥的檢測方法[16-18]，將樣品經乙腈高速勻漿提取后濃縮，采用液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質譜法（GC-MS/MS）進行檢測。

1 材料

1.1 樣品

菊花樣品分別來自浙江（39 批）、安徽（23批）、江蘇（8批）、河南（3批）、河北（5批）的飲片廠、藥店、種植基地、個體農戶等，具有較好的代表性。樣品經中國食品藥品檢定研究院王瑩副研究員鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序。

1.2 儀器

QP2040 型氣相色譜串聯質譜儀、LCMS-8060NX 型液相色譜串聯質譜儀、LC-40DXS 型液相色譜均購于日本島津公司；FA1004C FA/JA-C 型電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；AH30型高速全自動勻漿儀（睿科儀器有限公司）；Z260A型離心機（德國Hermble 公司）；Hel-VAP Advantage ML/HB型旋轉蒸發儀（德國Heidolph 公司）。

1.3 試藥

乙腈（色譜純，Thermo Fisher 公司）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水；農藥對照品來源于中國計量科學院、中國食品藥品檢定研究院、Ehrenstorfer 公司，以乙腈為溶劑配制成質量濃度為100 μg·mL-1的單標儲備溶液，-20 ℃密封避光保存備用。

2 方法與結果

2.1 測定條件

2.1.1 GC-MS/MS 分析條件 DM-17ms 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；柱流速為1.0 mL·min-1；恒流模式，進樣口溫度為240 ℃；不分流進樣；升溫程序（初始溫度為60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升 至300 ℃，保 持6 min，以20 ℃·min-1升 至320 ℃，保持3 min）；離子源溫度為200 ℃；離子源為電子轟擊源（EI）；EI 能量為70 eV；碰撞氣為氬氣；質譜傳輸接口溫度為250 ℃；采用多反應監測（MRM）模式。各農藥參考保留時間（tR）、監測離子對、碰撞電壓（CE）等信息見表1。為提高分析指標的檢測靈敏度，根據tR進行分段監測分析。

2.1.2 LC-MS/MS 分析條件 UPLC C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨），流動相B為95%乙腈水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨、0.1%甲酸），梯度洗脫（0～10 min，80%～5%A；10～12 min，5%A；12～13 min，5%～80%A；13～16 min，80%A）；柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL·min-1，進樣量2 μL。以三重四極桿串聯質譜儀檢測，電噴霧離子源（ESI），采用MRM 模式；毛細管電壓為2.5 kV，去溶劑溫度為550 ℃，離子源溫度為150 ℃；去溶劑氣體積流量為900 L·h-1，錐孔氣體體積流量為150 L·h-1，碰撞氣壓為48 kPa。各化合物參考tR、錐孔電壓、監測離子對見表2。為提高分析指標的檢測靈敏度，根據tR進行分段監測分析。

表2 LC-MS/MS測定農藥的tR、質譜參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取表1、表2 中農藥對照品5 mg 置50 mL 量瓶中，加乙腈溶解，稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液，存放于-20 ℃冰箱中避光密封保存。分別精密量取表1、表2 中各農藥對照品儲備液1～3 mL，置200 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別作為GC-MS/MS和LC-MS/MS測定用混合對照品溶液。

2.2.2 內標溶液的制備 精密稱取磷酸三苯酯，加乙腈溶解，制成內標儲備溶液（100 μg·mL-1），精密量取內標儲備液適量，加乙腈稀釋，配制成內標溶液（0.1 μg·mL-1）。

2.2.3 供試品溶液的制備 將供試品粉碎過三號篩，精密稱取粉末約5 g，加乙腈50 mL，加氯化鈉1 g，12 000 r·min-1勻漿處理3 min后，5000 r·min-1離心5 min（離心半徑為10 cm，下同），取上清液，沉淀加入乙腈50 mL，勻漿處理2 min，再次5000 r·min-1離心5 min，合并2 次上清液，40 ℃減壓濃縮至3～5 mL，定容至25 mL 量瓶中，搖勻，采用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 空白基質溶液的制備 精密稱定空白樣品粉末約5 g，置100 mL試管中，按2.2.3項下方法制備空白基質溶液。

2.2.5 基質混合對照品溶液的制備 精密量取混合對照品儲備溶液適量，加入空白基質溶液，制成對照品質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1的基質混合對照品溶液。

2.3 樣品測定

2.3.1 GC-MS/MS 測定 分別精密量取各系列質量濃度混合對照品溶液及供試品溶液1.0 mL，精密加入內標溶液0.3 mL，混勻，微孔濾膜濾過，精密吸取1 μL 注入氣相色譜串聯質譜儀進行測定，采用內標標準曲線法計算供試品溶液中農藥的殘留量。GC-MS/MS 測定空白基質匹配的混合對照品總離子流圖（圖1）。

圖1 GC-MS/MS測定菊花空白基質匹配的對照品總離子流圖

2.3.2 LC-MS/MS 測定 分別精密量取各系列質量濃度混合對照品溶液及供試品溶液1.0 mL，精密加水0.3 mL，混勻，微孔濾膜濾過，精密吸取2 μL注入液相色譜串聯質譜儀測定，采用外標標準曲線法計算供試品溶液中農藥的殘留量。LC-MS/MS 測定空白基質匹配的混合對照品總離子流圖（圖2）。

圖2 LC-MS/MS測定菊花空白基質匹配的對照品總離子流圖

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 對質譜條件進行優化調整，同時考慮到基質特點與響應值，選擇適合的MRM 離子對，使其適應菊花中的農藥多殘留檢測。實驗結果表明，菊花空白樣品基質對農藥殘留的干擾較小，表明方法專屬性較好。

2.4.2 定量限 取混合對照品溶液，使用乙腈進行逐級稀釋，按2.3 項下方法進行測定，以相關定量離子信噪比（S/N）為3∶1 時的質量濃度作為檢測限（LOD）。LOD結果見表3、表4。

表3 GC-MS/MS測定82種農藥的線性方程、r、LOD、回收率及精密度

表4 LC-MS/MS測定134種農藥的線性方程、r、LOD、回收率及精密度

2.4.3 標準曲線 取空白基質匹配的不同質量濃度混合對照品溶液，注入儀器進行測定，以質量濃度作為橫坐標（X）、峰面積作為縱坐標（Y），繪制標準曲線。實驗結果表明，216 種農藥的r為0.960～0.999，其中90%的農藥r＞0.995，表明方法線性關系良好，結果見表3、表4。

2.4.4 精密度試驗 取同一份供試品溶液，連續進樣6 次，各待測峰面積RSD 均小于10.0%，符合痕量多殘留分析技術要求，結果見表3、表4。

2.4.5 加樣回收率試驗 取菊花空白樣品粉末約5 g，分別加入10、50、100 μg·kg-13 個水平的混合對照品，每個水平重復3 次，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液并按2.3 項下方法測定，測得結果使用隨性標注曲線進行計算。結果表明，各待測指標3 個水平的加樣回收率均為70%～115%，RSD均小于10.0%，實驗結果符合殘留痕量分析要求，結果見表3、表4。

2.5 測定結果

對78 批菊花中的216 種農藥進行了篩查，其中68個農藥有檢出（表5）。

表5 菊花中農藥殘留檢出情況

3 討論

3.1 農藥參數的選擇

本研究在進行檢測指標的選擇時，選取了對菊花樣品監測具有重要意義的216 種農藥進行GC-MS/MS和LC-MS/MS檢測分析。本研究選擇檢測指標的依據：1）我國除《中國藥典》2020 年版規定的33種禁限用農藥外的禁限用農藥，包括部分農藥有毒理學意義的代謝產物；2）登記過的菊花種植中可使用的農藥，如井岡霉素A、吡蟲啉、啶蟲脒、吡唑醚菌酯等；3）菊花種植過程中實際使用的農藥，如戊唑醇、丙溴磷、多菌靈、霜霉威、腐霉利、吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉等；4）我國農業生產中部分常用的農藥；5）適合采用GC-MS/MS 或LC-MS/MS 測定的農藥。

3.2 樣品前處理方法的選擇

農藥殘留分析中常用的提取溶劑有丙酮、乙酸乙酯和乙腈等，丙酮與水互溶且易提取出色素等雜質，乙酸乙酯對極性大的農藥回收率偏低，乙腈可提取極性范圍較寬的多種農藥殘留，可避免大多數親脂性雜質的干擾。本研究參考《中國藥典》2020年版（四部）中2341 農藥殘留量測定法（第五法）［19］，選擇乙腈為提取溶劑，對菊花的前處理方法進行了考察和優化，包括乙腈高速勻漿直接提取法、快速樣品處理法（QuEChERS）、直接提取法提取后通過親水親脂固相萃取（HLB）柱凈化3 種方法。從回收率結果來看，3 種方法回收率均為70%～120%，符合要求。本研究采用直接提取法基本可滿足分析要求，此法操作簡便、成本低，提高了農藥分析的效率。

3.3 農藥多殘留測定結果分析

菊花種植過程中病蟲害較多，規模化種植過程中多使用農藥，因此本研究檢出的農藥種類較多，且所有批次樣品中均有農殘檢出，檢出農藥數最多的一批樣品檢出農藥38 種，平均每批菊花檢出農藥11 種。在本研究選擇的農藥指標中，吡唑醚菌酯、吡蟲啉、吡蚜酮、啶蟲脒、噻蟲嗪和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽已登記用于菊花，為可以使用的農藥，其他農藥未登記。檢出率超過20%的農藥為吡唑醚菌酯、啶蟲脒、多菌靈、戊唑醇、蟲螨腈、噻蟲嗪、吡蟲啉、茚蟲威、烯酰嗎啉、丙溴磷、甲氧蟲酰肼、苯醚甲環唑、霜霉威鹽酸鹽、氯氰菊酯、丙環唑、噠螨靈，其中檢出率超過50%的農藥為吡唑醚菌酯、啶蟲脒、多菌靈、戊唑醇、蟲螨腈、噻蟲嗪，檢出農藥均為菊花實際種植中可能使用的農藥。雖然，菊花中農藥殘留檢出率較高、檢出品種較多，但多為中低毒性農藥。

本研究建立了菊花中216 種常用農藥殘留的快速檢測方法，經過驗證，方法簡便快捷、靈敏度高、選擇性好，適用于菊花農藥多殘留的快速篩查分析，對菊花中農藥殘留監測有一定參考價值。所檢測的農藥殘留數據為進一步風險評估提供了基礎數據。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。