RNAi 沉默 CCR3 對變應性鼻炎嗜堿性粒細胞遷移、活化及脫顆粒的影響

廖兵 楊春平 易韻 劉月輝 朱新華 劉建國 汪美群 劉軻 陳旭波 張皓 田小燕

(1南昌大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,江西 南昌 330006;2江西省腫瘤醫院婦瘤科)

變應性鼻炎(AR)是接觸過敏原后,特異性個體產生大量IgE抗體,后者可介導組胺等炎癥介質釋放,激活免疫活性細胞和促炎細胞,在鼻黏膜發生Ⅰ型變態反應性的疾病。我國是AR高發地區,患病率較高,并且隨著國家工業化程度提高而呈逐年上升趨勢〔1〕,嚴重影響患者工作和生活質量。目前研究已了解變應性疾病的發病機制,但影響免疫反應的因素多樣且復雜,尚有較多的關鍵問題亟待深入了解。目前尚未有研究對RNA 干擾(RNAi)基因沉默CC趨化因子受體(CCR)3對AR嗜堿性粒細胞功能進一步探討,本研究使用RNAi技術沉默CCR3 基因來阻斷CCR3/嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)路徑,探索此過程中嗜堿性粒細胞在骨髓、外周血及鼻腔的募集、遷移及成熟過程的變化,探討RNAi 沉默CCR3對AR嗜堿性粒細胞遷移、活化及脫顆粒的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗動物:8周齡的SPF級雄性健康小鼠共48只,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。恒溫恒濕環境下分籠飼養,提供無菌飼料及飲水。本研究通過倫理委員會批準,符合動物倫理要求。主要試劑:Trizol 試劑購自上海信乎生物科技有限公司,蘇木素-伊紅(HE)試劑盒購自深圳逗點生物技術有限公司,放射免疫沉淀(RIPA)裂解液購自北京康為世紀生物科技有限公司,二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒購自廣州翔博生物科技有限公司,逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,慢病毒購自蘇州吉瑪基因科技有限公司。主要儀器:全自動研磨儀購自武漢賽維爾科技有限公司,凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司,蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司,透射電子顯微鏡購自日本HITACHI公司。

1.2構建AR模型 參考文獻方法〔2〕,取36只小鼠建立AR模型:腹腔注射10 μg卵清白蛋白/4 mg氫氧化鋁混合液進行基礎致敏,2次/d,共14 d;于第21～27天以卵清白蛋白在鼻腔內進行局部激發。另取12只正常小鼠腹部注射或鼻腔滴入等體積生理鹽水進行對照。最后1次激發試驗后,觀察小鼠鼻部癥狀表現,如短時間內出現持續抓鼻、摩擦、打噴嚏、鼻腔內有較多分泌物則判定為AR模型建立成功。

1.3設計并合成小鼠CCR3siRNA 根據NCBI 數據庫,查出小鼠CCR3 mRNA 序列全長,并合成設計其siRNA基因引物序列(5′-3′)為:CCR3siRNA1正義鏈:GGGCUCUUUAGAUGUUUGATT,反義鏈:UC-AAACAUCUAAAGAGCCCTT;CCR3siRNA2正義鏈:GCUGAGAUGUCCCAAUAAATT,反義鏈:UUUAUU-GGGACAUCUCAGCTT;CCR3siRNA3正義鏈:GCCUGUGUUUCUAUCAUUATT,反義鏈:UAAUGAUAGA-AACACAGGCTT;CCR3siRNA4正義鏈:GCUGUA-UUAAUCCAGUAAUTT,反義鏈:AUUACUGGAU-UAAUACAGCTT。經前期實驗,確定CCR3siRNA3抑制CCR3表達效果最好,故選用CCR3siRNA3作為本次研究的目標基因序列。

1.4CCR3siRNA干預及分組 建AR模型同時,于第0、7、14天,經鼻緩慢滴入20 μl CCR3siRNA對照試劑(對照組)、CCR3siRNA(干預組)和等量生理鹽水(模型組);且在第21～28天激發試驗3 h前,相應組別小鼠再次經鼻緩慢滴入20 μl CCR3siRNA對照試劑、CCR3siRNA和生理鹽水,左右鼻側各滴入10 μl。正常對照的小鼠在同樣時間滴入生理鹽水(正常組)。

1.5外周血、骨髓和鼻黏膜相關指標檢測 實驗結束后,利用異氟烷對小鼠進行麻醉,摘取眼球取外周血,室溫條件下3 000 r/min離心10 min,收集上清液備用。利用頸椎脫臼法處死小鼠,取出鼻中隔黏膜組織,保存于冰箱中備用。暴露并剪取小鼠股骨和脛骨,往骨腔內注入生理鹽水,收集骨髓沖洗液,保存備用。

1.5.1Western印跡檢測CCR3蛋白表達 提取本實驗獲得的組織勻漿或血清總蛋白,使用BCA蛋白定量法,對提取的總蛋白進行定量測定。設置好濃縮膠電壓和分離膠電壓,進行烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉印。取聚偏氟乙烯膜用洗滌緩沖液洗膜,封閉、室溫搖床孵育。 洗膜后,先后加入一抗、二抗,孵育后。聚偏氟乙烯膜表面滴入新鮮配制的化學發光液滴,并轉移至成像分析系統中,采集圖像并分析CCR3蛋白相對表達量。

1.5.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測CCR3 mRNA表達 提取本實驗獲得的組織勻漿或血清總RNA,根據cDNA逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA,再用熒光定量試劑盒擴增和定量,PCR引物序列(5′-3′)為:CCR3上游:5′-GCGTTTGGACATCAGCTTGA-3′,下游:5′-ACGAT-TGTTCCGAAGCTTTGG-3′;GAPDH上游:GAAGGTGAAGGTCGGAGT,下游:GAAGATGGTGATGGGAT-TTC;設置好PCR體系和反應條件。以2-ΔΔCt公式計算CCR3 mRNA相對表達量。

1.5.3ELISA檢測組胺、類胰蛋白酶、白細胞介素(IL)-3和IL-5水平將本實驗獲得的組織勻漿或血清,用相應的ELISA試劑盒檢測外周血和鼻黏膜組胺、IL-3、IL-5和類胰蛋白酶濃度。

1.5.4鼻黏膜形態學觀察 收集鼻黏膜組織,用4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片,制作鼻黏膜標本,并使用HE進行染色,在光學顯微鏡下觀察小鼠鼻黏膜的病理變化。

1.5.5流式細胞儀檢測CD34+細胞水平 收集骨髓和外周血,制作單個核細胞懸液,加入抗CD34+體標記細胞,采用流式細胞儀檢測CD34+細胞水平。

1.6細胞實驗 模型組最后1次激發結束時,提取骨髓嗜堿性粒細胞體外培養,在體外利用小鼠骨髓干細胞誘導獲得高純度的嗜堿性粒細胞。取對數期生長的的細胞分別加入CCR3siRNA(CCR3siRNA組)、CCR3siRNA對照試劑(CCR3siRNA對照組)和PBS 液(空白組)進行培養。采用甲苯胺藍染色法觀察細胞的成熟度,并按公式(脫顆粒百分率=脫顆粒細胞數/所計數的100 個細胞×100%)計算其百分率。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1CCR3siRNA對AR小鼠CCR3表達的影響 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,與正常組比較,模型組、對照組和干預組CCR3蛋白和mRNA表達水平明顯升高(均P<0.05);與模型組和對照組比較,干預組CCR3蛋白和mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組外周血、鼻黏膜、骨髓CCR3蛋白表達

表1 各組外周血、鼻黏膜、骨髓中CCR3蛋白及mRNA表達

2.2CCR3siRNA對AR小鼠鼻黏膜形態學的影響 正常組鼻黏膜組織結構完整,排列整齊,黏膜及黏膜下組織未見腫脹,組織少許或無炎性細胞浸潤。與正常組比較,模型組和對照組鼻黏膜結構不清,黏膜及黏膜下層腫脹,可見炎性細胞浸潤。干預組上述鼻黏膜結構被破壞,但較模型組和對照組有所改善。見圖2。

圖2 各組鼻黏膜(HE染色,×100)

2.3CCR3siRNA對AR小鼠組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平的影響 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,與正常組比較,模型組、對照組和干預組組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組和對照組比較,干預組組胺、類胰蛋白酶、IL-3和IL-5表達水平明顯降低(均P<0.05)。見表2。

2.4CCR3siRNA對AR小鼠外周血和骨髓CD34+細胞表達的影響 在外周血和骨髓中,與正常組比較,模型組、對照組和干預組CD34+細胞百分率明顯升高(P<0.05)。與模型組和對照組比較,干預組CD34+細胞百分率明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血和鼻黏膜中組胺、類胰蛋白酶、IL-3、IL-5水平及外周血和骨髓CD34+細胞百分率比較

2.5CCR3siRNA對嗜堿性粒細胞脫顆粒的影響 與CCR3siRNA對照組〔(3.51±1.01)%〕和空白組〔(3.93±1.25)%〕比較,CCR3siRNA組脫顆粒細胞百分率〔(0.97±0.46)%〕明顯降低(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組嗜堿性粒細胞脫顆粒(甲苯胺藍染色,×200)

3 討 論

以往研究中,過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性皮炎等變態反應疾病中的炎癥組織均發現嗜堿性粒細胞的浸潤〔3～6〕。有證據表明,在鼻腔受到變應原激發后輔助型T細胞(Th)2細胞連續性激活,嗜堿性粒細胞、T 細胞和樹突細胞(DCs)的數量增多,在受到變應原激發后發揮效應細胞作用〔3〕。在正常情況下,嗜堿性粒細胞只存在于外周血中,且只有較少的數量,但其在發生變態反應疾病時,其亦迅速募集到炎癥部位,同時釋放足夠數量的炎癥介質,促使超敏反應發生。研究證明,CCR3/Eotaxin 軸在Th2 淋巴細胞浸潤過敏的組織中具有重要作用,CCR3 作為Eotaxin 唯一結合的受體〔7,8〕,在介導嗜堿性粒細胞遷移具有關鍵作用,因此下調CCR3表達對改善AR癥狀具有潛在的治療意義。RNAi是目前熱門的基因阻斷技術,具有沉默基因表達的功能。 RNAi 通過抑制重要基因表達,有望成為干預治療變應性疾病的新方法。目前已有利用 siRNA 來治療臨床疾病的研究,其具有持續時間長的特點〔9,10〕。因此設想針對嗜堿性粒細胞趨化、合成、釋放介質等功能的關鍵基因,采用 RNAi 抑制基因表達進行RNA 干預,控制嗜堿性粒細胞產生,從而消除其在變應性疾病發生發展機制中的作用。本研究結果提示,CCR3siRNA干預利于改善AR癥狀。此外,CCR3siRNA具有抑制CCR3表達的作用。

從免疫學角度了解AR,機體受到過敏源等體外環境因素影響,造成Th1/Th2 平衡失調〔11,12〕,導致以Th2 免疫反應為主導變應性炎癥反應〔13〕。其他研究顯示,Th2 細胞可分泌IL-3 、IL-5和IL-13 等細胞因子〔14〕,后者作用于嗜堿性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞產生多種生理學效應,包括AR的變態反應。本研究結果表明,CCR3siRNA可以減輕細胞因子引起的變應性炎癥反應放大效應。嗜堿性粒細胞胞質內含嗜堿性顆粒,這些顆粒內含有組胺等致敏性物質,當細胞脫顆粒后胞膜隨即破裂,致敏性物質向外周血和周圍組織釋放,持續加重過敏灶Ⅰ型變態反應的發生發展。本研究表明,CCR3siRNA在嗜堿性粒細胞脫顆粒具有重要作用,能影響釋放組胺、類胰蛋白酶等致敏物質的釋放。CD34+祖細胞在受到變應原刺激后CCR3表達增加,激活CD34+祖細胞由骨髓向血液中釋放成熟的嗜堿性粒細胞〔15〕,后者經血液循環向氣道遷移而在炎癥組織聚集。表明CCR3/Eotaxin 途徑在變應性疾病發病過程中促使CD34+祖細胞從骨髓中釋放嗜堿性粒細胞過程中具有重要作用〔16〕。本研究表明,CCR3siRNA可以降低CD34+細胞表達,間而抑制嗜堿性粒細胞細胞活化。

綜上,應用RNAi技術可以沉默CCR3表達,CCR3表達降低可抑制嗜堿性粒細胞細胞活化、遷移以及脫顆粒,利于改善AR癥狀。