PD-1溶瘤病毒對小鼠卵巢癌的抗腫瘤活性

唐國玲 黃山鷹 劉剴 胡海燕 曾薇薇 蘇圣梅 閻愷

(南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院婦科,廣東 深圳 518000)

卵巢癌發病初期無特異性癥狀,約2/3的患者就診時已達到國際婦產科聯盟(FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期,手術治療效果不佳,需要聯合術后化療,對順鉑、紫杉醇等化療藥物耐藥性增加時不良預后的主要原因之一〔1〕。程序性細胞死亡蛋白(PD)-1與其配體結合后能夠抑制T細胞活性,誘發腫瘤免疫逃逸〔2〕;PD-1抗體能夠降低PD-1活性,提高免疫細胞的抗腫瘤作用;但由于PD-1抗體的組織穿透性較差,難以達到腫瘤病灶處,降低了其療效〔3〕。溶瘤病毒具有抗癌作用的同時還能夠增強活化T細胞浸潤,與抗PD-1抗體結合后可提高其組織穿透性,增強抗腫瘤作用〔4〕。本研究探討PD-1溶瘤病毒對卵巢癌的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 SPF級雄性C57BL/6J小鼠,體質量(20±2)g,購于上海交通大學醫學院實驗動物中心,許可證號:SYXK(滬)2023-0007。人卵巢癌SKOV-3細胞株購于上海昆盟生物科技有限公司。PD-1、溶瘤單純皰疹病毒(oHSV)購買以及PD-1溶瘤病毒構建由上海和元生物技術有限公司完成。DMEM細胞培養基、胎牛血清購于青島捷世康生物科技有限公司;淋巴細胞分離液、PE標記小鼠抗人CD4單克隆抗體、PE標記小鼠抗人CD8單克隆抗體均購于天津梅德生物科技有限公司;酶聯免疫檢測試劑盒〔白細胞介素(IL)-2、IL-10、干擾素(IFN)-γ〕均購于仁捷(上海)生物科技有限公司;免疫組化(SP)檢測試劑盒(P53、Ki67)購于北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.2造模及PD-1溶瘤病毒最佳滴度篩選 復蘇人卵巢癌SKOV-3細胞株后使用含胎牛血清的DMEM細胞培養基培養、傳代,調整細胞密度為1×107/ml,向小鼠右前腋下注射0.2 ml細胞懸液,繼續培養14 d后篩選出現移植瘤的小鼠進行后續研究。為篩選PD-1溶瘤病毒最佳滴度,分別將滴度為5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108的PD-1溶瘤病毒注射入卵巢癌腫瘤內部,每個滴度5只小鼠,同時設置5只小鼠為空白對照。每2 d注射1次,注射3次,末次注射結束后繼續培養7 d,測量腫瘤長徑、短徑,計算卵巢癌腫瘤體積。

1.3分組與腫瘤體積測量 取卵巢癌造模成功的小鼠64只,隨機分為模型組(靜脈注射等量生理鹽水),PD-1抗體組(靜脈注射PD-1單克隆抗體,200 μg),單獨溶瘤病毒組(瘤內注射oHSV病毒,滴度5×107),PD-1溶瘤病毒組(瘤內注射PD-1溶瘤病毒,PD-1溶瘤病毒),每組16只。同時設置對照組(正常喂養的小鼠,靜脈注射等量生理鹽水)16只。每2 d注射1次,注射3次,末次注射結束后繼續培養7 d,測量腫瘤長徑、短徑,計算卵巢癌腫瘤體積。

1.4標本采集與處理 測量完腫瘤長徑、短徑后麻醉小鼠并稱重,腹主動脈取血后處死小鼠,剪下腫瘤組織并稱重,記錄腫瘤質量;取出脾臟、胸腺并稱重,計算脾指數、胸腺指數。將收集的部分血液標本離心處理,-80 ℃保存待測;另外一部分血液標本放于適量的紅細胞裂解液中,得到外周血T淋巴細胞,磷酸緩沖液重懸、混合均勻后計數備用。將腫瘤組織常規制成石蠟切片,用于免疫組化檢測。

1.5各組小鼠T淋巴細胞亞群檢測 取各組小鼠的外周血T淋巴細胞約1×107個,配制成500 μl的細胞懸液,分別加入PE標記小鼠抗人CD4單克隆抗體、PE標記小鼠抗人CD8單克隆抗體后混合均勻,避光靜置30 min,離心后棄去沉淀,磷酸緩沖液重懸后上流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群,記錄CD4+、CD8+比例,計算CD4+/CD8+比值。

1.6各組小鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ濃度檢測 取各組小鼠-80 ℃保存的血清樣本,復溫后吸出0.3 ml,按試劑盒說明書中的步驟,酶聯免疫吸附法測定血清IL-2、IL-10、IFN-γ濃度。

1.7SP法檢測各組小鼠P53、Ki67表達檢測 取腫瘤組織石蠟切片,烤片30 min,二甲苯浸泡后梯度濃度的酒精脫水,過氧化氫去除內源性過氧化物酶活性,修復抗原后封閉非特異性抗原;滴加一抗:鼠抗人P53單克隆抗體(1∶1 000倍稀釋),鼠抗人Ki67單克隆抗體(1∶500倍稀釋),鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶4 000倍稀釋),室溫下孵育1 h,滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗屬IgG(1∶4 000倍稀釋),顯色、復染、脫水、透明后封片。顯微鏡下隨機計數200個細胞,計算陽性細胞比例,根據陽性細胞比例和染色強度進行評分,使用兩者的乘積判定結果,陰性(0分)、弱陽性(1～2分)、中等陽性(3～4分)、強陽性(>4分),將中等陽性和強陽性記為陽性。

1.8統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行χ2檢驗、方差分析,組間兩兩比較進行LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同滴度PD-1溶瘤病毒對腫瘤體積的影響 PD-1溶瘤病毒滴度0、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108時腫瘤體積依次為(308.51±12.80)、(269.83±15.65)、(236.24±11.97)、(213.69±9.41)、(189.47±8.29)、(173.59±7.85)、(171.06±8.53)mm3。不同PD-1溶瘤病毒滴度的卵巢癌小鼠之間腫瘤體積比較差異有統計學意義(F=30.958,P=0.000);隨著PD-1溶瘤病毒滴度的升高腫瘤體積逐漸降低。當PD-1溶瘤病毒滴度達到5×107時卵巢癌小鼠腫瘤體積不再明顯降低,與1×108時腫瘤體積之間比較差異無統計學意義(P>0.05),因此后續實驗以PD-1溶瘤病毒滴度5×107處理卵巢癌小鼠。

2.2各組腫瘤體積、腫瘤質量比較 各組腫瘤體積、腫瘤質量比較差異有統計學意義(P<0.001);模型組腫瘤體積、腫瘤質量明顯高于對照組(P<0.05),PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組腫瘤體積、腫瘤質量明顯低于模型組,PD-1溶瘤病毒組腫瘤體積、腫瘤質量明顯低于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組(均P<0.05)。見表1。

2.3各組脾臟指數、胸腺指數水平比較 各組脾臟指數、胸腺指數比較差異均有統計學意義(P<0.05);模型組脾臟指數、胸腺指數明顯低于對照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組脾臟指數、胸腺指數明顯高于模型組,PD-1溶瘤病毒組脾臟指數、胸腺指數明顯高于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組(P<0.05)。見表1。

2.4各組T淋巴細胞亞群比較 各組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異均有統計學意義(P<0.05);模型組CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對照組,CD8+明顯高于對照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組CD4+、CD4+/CD8+明顯高于模型組,CD8+明顯低于模型組(P<0.05);PD-1溶瘤病毒組CD4+、CD4+/CD8+明顯高于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組,CD8+明顯低于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤體積、腫瘤質量、脾臟指數、胸腺指數水平、T細胞浸潤水平比較(n=16)

2.5各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平比較 各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ比較差異均有統計學意義(P<0.05);模型組血清IL-2、IFN-γ明顯低于對照組,IL-10明顯高于對照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組血清IL-2、IFN-γ明顯高于模型組,IL-10明顯低于模型組;PD-1溶瘤病毒組血清IL-2、IFN-γ明顯高于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組,IL-10明顯低于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組(P<0.05)。見表2。

2.6各組P53、Ki67陽性表達比較 各組P53、Ki67陽性率比較差異均有統計學意義(P<0.05);模型組P53、Ki67陽性率明顯高于對照組(P<0.05);PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組、PD-1溶瘤病毒組P53、Ki67陽性率明顯低于模型組;PD-1溶瘤病毒組P53、Ki67陽性率明顯低于PD-1抗體組、單獨溶瘤病毒組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平、P53、Ki67陽性表達比較

3 討 論

卵巢癌發病早期癥狀隱匿,診斷難度高,導致患者無法得到及時治療、致死率高。相關研究顯示,無盆腔淋巴結轉移的卵巢癌患者5年生存率在40%左右,當出現盆腔淋巴結轉移后患者的5年生存率下降至10%左右〔5〕。手術難以根治卵巢癌是患者不良預后的主要原因之一,需要聯合術后化療(順鉑、紫杉醇等),但耐藥性發生率高,還可能引發外周免疫系統功能抑制〔6〕;因此,探尋新的治療手段對延長患者的生存時間具有重要意義。本研究結果提示,PD-1抗體、單獨溶瘤病毒、PD-1溶瘤病毒干預均能夠控制卵巢癌小鼠病情進展,其中PD-1溶瘤病毒效果最明顯。

脾臟和胸腺在腫瘤免疫治療中發揮重要作用,脾臟指數、胸腺指數減小會導致外周血白細胞比例下降、免疫功能減退,抗腫瘤活性降低〔7,8〕。T淋巴細胞主要包括CD4+、CD8+,在腫瘤免疫微環境中發揮抗腫瘤作用〔9〕。激活T淋巴細胞能夠殺滅腫瘤相關的自身抗原,但多數惡性腫瘤患者無法自發激活抗原特異性T淋巴細胞〔10〕。IL-2與IFN-γ具有免疫效應細胞活性,能夠提高人體的免疫功能,與免疫治療效果密切相關〔11〕。IL-10具有免疫抑制作用,其高表達會降低腫瘤免疫治療效果〔12〕。PD-1是免疫負調控因子,能夠抑制免疫系統功能,降低免疫細胞對腫瘤的殺傷活性〔13〕。抗PD-1抗體能夠抑制PD-1活性,提高免疫細胞的抗腫瘤作用。但單克隆PD-1抗體組織穿透力較弱,難以到達腫瘤病灶;溶瘤病毒組織穿透力強,在具有抗腫瘤活性的同時還可作為載體工具〔14〕。本研究中通過構建PD-1溶瘤病毒,明顯提高了對卵巢癌的免疫調節作用,增強特異性抗腫瘤免疫細胞的殺傷能力,提高療效。

P53基因是與人體腫瘤相關性最高的基因,引發腫瘤形成和惡性轉化的P53蛋白是P53基因突變的產物,發揮腫瘤促進作用,會抵消野生型P53基因的抑癌作用〔15〕。相關研究顯示,50%以上高惡性程度的漿液性卵巢癌組織中存在P53突變〔16〕。Ki67陽性表達于細胞核中,與核糖體轉錄相關,是評估腫瘤細胞活性的指標〔17〕。研究顯示,Ki67代表有絲分裂指數,在G0靜息期外的循環細胞中均有表達,腫瘤細胞增殖活性的提升說明惡性程度的增加〔18〕。本研究結果提示,PD-1溶瘤病毒可通過下調P53、Ki67表達來抑制卵巢癌的發展,且相比于單獨PD-1抗體、溶瘤病毒作用更強。