雷帕霉素對細胞縫隙連接功能和連接蛋白表達的影響

魏爾婷,趙青,鐘意,湯南

(廣東醫科大學藥學院,廣東 東莞 523808)

細胞縫隙連接(gap junction,GJ)是由連接蛋白(connexin,Cx)組成的一種膜通道結構,位于細胞膜上的6個Cx組成一個半通道(或稱“連接子”),來自相鄰細胞膜上的兩個半通道對接組成一個GJ通道,離子、小分子、第二信使等物質和信號可通過GJ在相鄰細胞間擴散傳遞[1-3]。Cx作為組成GJ的基本單元,有多種亞型形式。目前,在人類中至少已鑒定出21種Cx亞型[4],并依據其分子量大小進行命名。不同Cx組成的GJ通道對信號物質表現出一定的特異通透性,因而可調節不同的生理功能[5]。GJ所介導細胞縫隙連接通訊在許多生物活動中至關重要,如細胞增殖分化、免疫應答、神經活動等[6-8]。雷帕霉素(rapamycin)屬于大環內酯類化合物,是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶—雷帕霉素機械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)的抑制劑[9-10],具有免疫抑制、誘導自噬、抗腫瘤等多種藥理作用[10-15],探討雷帕霉素對GJ功能是否有調控作用,可為其作用機制的研究提供參考。因此,本實驗在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、大鼠肝細胞(BRL-3A)和小鼠肝細胞(AML12)上,觀察雷帕霉素對不同細胞GJ功能及Cx蛋白表達的影響。

1 試驗材料

1.1 細胞人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自ScienCell公司;大鼠肝細胞(BRL-3A)和小鼠肝細胞(AML12)購自中國科學院。

1.2 藥品與試劑雷帕霉素(Aladdin公司);CCK-8試劑盒(Dojindo公司);Calcein-AM(Invitrogen公司);內皮細胞培養基、生長因子及胎牛血清(Scien Cell公司);DMEM培養基(Gibco公司);AML12完全培養基(中國科學院);0.25%胰酶和青鏈霉素(Gibco公司);Cx32抗體(Santa Cruz公司);Cx37抗體(Abcam公司);β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司);羊抗鼠二抗(Sigma-Aldrich公司);羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術股份有限公司)。其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器IX73熒光倒置顯微鏡(Olympus公司);酶標儀(BioTek Instruments公司)。

2 方法

2.1 細胞培養HUVEC采用內皮細胞專用培養基(含5%胎牛血清,1%生長因子及1%青鏈霉素),BRL-3A采用DMEM完全培養基(含10%胎牛血清及1%青鏈霉素),AML12采用AML12完全培養基(含10%胎牛血清、ITS液體培養基補充劑及地塞米松),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中常規培養,采用胰酶消化傳代。

2.2 細胞活力測定采用CCK-8法測定不同濃度雷帕霉素作用HUVEC、BRL-3A和AML12細胞后,對細胞生長的影響。細胞以5×104mL-1的密度(100 μL/孔)接種于96孔板中,置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。實驗組分別加入5、10、25、50 nmol·L-1雷帕霉素作用2 h后(每組5個復孔),加入10%(V/V) CCK-8溶液繼續培養3 h,用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度值。與溶劑對照組比較,計算實驗組細胞的存活率。

2.3 細胞接種熒光示蹤法采用細胞接種熒光示蹤法檢測雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A和AML12細胞GJ功能的影響。細胞接種熒光示蹤法為[16]:取一孔細胞加入熒光試劑Calcein-AM孵育30 min,作為“供體細胞”,Calcein-AM在細胞內經酯酶水解為具有GJ通透性的calcein,將負載好熒光指示劑的“供體細胞”消化并稀釋,按500 mL-1接種至已生長融合的“接受細胞”,培養4 h。倒置熒光顯微鏡下觀察,計數1個“供體細胞”周圍含calcein綠色熒光的“接受細胞”數,與溶劑對照組比較,以熒光傳遞率作為GJ功能的評價指標。

將HUVEC、BRL-3A和AML12細胞以6×104mL-1密度接種于12孔板中,培養至細胞生長融合。實驗組分別加入5、10、25、50 nmol·L-1雷帕霉素作用2 h,對照組采用溶劑處理。按上述細胞接種熒光示蹤法評價細胞的GJ功能。

2.4 Western blotting采用Western blotting檢測不同濃度雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A和AML12細胞Cx表達的影響。雷帕霉素作用細胞2 h后,裂解細胞,超聲處理并在4 ℃,12 000×g的條件下離心15 min,取上清,進行蛋白定量。將25 μg蛋白樣品用SDS-PAGE進行分離后轉移到PVDF膜上。在室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉1 h后,分別加入一抗4 ℃孵育過夜(Cx37 1∶2 000,Cx32 1∶800,β-actin 1∶1 000),然后在室溫下加入二抗孵育1 h,采用凝膠成像系統采集圖像,分析條帶灰度值。

3 結果

3.1 雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A、AML12細胞存活率的影響CCK-8結果顯示,與對照組相比,5、10、25、50 nmol·L-1雷帕霉素作用HUVEC、BRL-3A和AML12細胞2 h后,細胞存活率無統計學差異(P>0.05)。結果表明,以上濃度雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A和AML12細胞無毒性作用。因此,選擇5、10、25、50 nmol·L-1作為后續試驗的濃度。

3.2 雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A、AML12細胞GJ功能的影響5、10、25、50 nmol·L-1雷帕霉素分別作用HUVEC、BRL-3A和AML12細胞2 h后,“細胞接種熒光示蹤法”結果顯示,與溶劑對照組相比,雷帕霉素組含calcein綠色熒光的“接受細胞”數量減少(見圖1A);統計結果表明,不同濃度雷帕霉素作用于HUVEC、BRL-3A、AML12細胞后,calcein熒光傳遞率均顯著性下降(P<0.05),并且當濃度為50 nmol·L-1時,對3種細胞的GJ功能抑制作用達到最大(見圖1B)。以上結果表明雷帕霉素可降低calcein在HUVEC、BRL-3A及AML12細胞間的傳遞,對3種細胞GJ功能具有一定的抑制作用。

A.作用于HUVEC、BRL-3A、AML12細胞的熒光傳遞圖;B.定量分析結果圖1 不同濃度雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A、AML12細胞GJ功能的影響注:與溶劑對照組相比,*P<0.05。

3.3 雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A、AML12細胞Cx蛋白表達的影響Western blotting結果顯示(見圖2),與溶劑對照組相比,Cx37及Cx32的蛋白表達呈下降趨勢,并且當濃度為25、50 nmol·L-1時,兩種Cx蛋白表達量顯著性降低(P<0.05),說明雷帕霉素對Cx37及Cx32蛋白表達具有一定的下調作用。

A.作用于HUVEC細胞;B.作用于BRL-3A細胞;C.作用于AML12細胞圖2 不同濃度雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A、AML12細胞連接蛋白的影響注:與溶劑對照組相比,*P<0.05。

4 討論

GJ是細胞間傳遞信息和能量的重要通道之一,由不同的Cx亞型組成。本研究中,HUVEC細胞主要表達Cx37、Cx40和Cx43[17],BRL-3A細胞主要表達Cx32和Cx43[18],AML12細胞主要表達Cx32和Cx26[19],結果顯示,在不引起細胞毒性的條件下,雷帕霉素對3種不同的細胞GJ通道均表現出一定的抑制作用。GJ是高度動態的結構,其調控受到多種因素的影響,如鈣離子濃度、pH、跨膜電壓、Cx翻譯后修飾及Cx構象變化等可直接調節GJ通道的開啟和關閉[2,6];Cx基因轉錄后的蛋白表達數量及在細胞膜上的分布可引起質膜上GJ通道數目的變化[20]。近年來的研究還表明,Cx的降解和定位與自噬有關[21]。Cx內化后可與自噬運輸蛋白或其他自噬相關蛋白相互作用,經由自噬途徑進行降解[22]。

雷帕霉素作為常用的自噬誘導劑,可通過抑制mTOR活性,促進細胞自噬。研究發現,在H9C2細胞中,雷帕霉素可以抵消Apelin-13引起的Cx43蛋白表達的增加,下調Cx43的表達[23];也可通過促進自噬的發展,抑制由血管緊張素Ⅱ和Apelin-13誘導的Cx43表達和分布[24]。本研究選擇了實驗細胞主要的GJ蛋白Cx37和Cx32作為檢測指標,結果表明雷帕霉素均可降低Cx37和Cx32的表達,說明其對Cx具有一定的調控作用。雷帕霉素對GJ功能及Cx的下調機制與自噬誘導是否有關,值得進一步的探討。

綜上所述,雷帕霉素對HUVEC、BRL-3A和AML12細胞的GJ功能具有抑制作用,并可下調GJ蛋白Cx37和Cx32的表達。這種對GJ通道的直接作用可能影響信號物質在細胞間的傳遞,從而調控細胞生物學行為。本研究可為雷帕霉素的藥理作用機制探討提供參考。