復合乳酸菌腸溶膠囊增強腎衰寧膠囊對腎纖維化保護作用研究

楊昊,宋顯瑞,張蕾

(1江蘇省食品藥品監督檢驗研究院,江蘇 南京 210019;2.南京中醫藥大學,江蘇 南京 210000)

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)是發病率頗高且對人體造成嚴重危害的疾病之一,如今患有慢性腎病的人越來越多,并逐漸年輕化。每年有超過10%的成年人患慢性腎病[1]。其中,腎纖維化是一個緩慢進展的病理過程,是慢性腎病中晚期的主要病理表現,在多種臨床疾病的發生發展中扮演重要角色[2]。由結石、感染和腫瘤等引起的慢性梗阻性疾病導致的腎損傷演變成腎纖維化最為常見,可導致有效腎單位的喪失和腎功能不可逆的進行性下降,最終導致腎衰竭[3]。然而目前對于腎纖維化的發生發展,臨床上尚無有效的防治手段。

腎衰寧膠囊(Shenshuaining Capsules,SSN)是收載于《中國藥典》2020年版的中藥復方制劑,由大黃、太子參、黃連、法半夏、陳皮、茯苓、紅花、丹參、牛膝、甘草十味藥物組成,具有益氣健脾、活血化瘀、通腑泄濁的功效,常用于治療慢性腎功能不全者[4]。對于腎衰竭末期需要進行透析的患者,通過口服腎衰寧膠囊可以提高患者生活質量。但腎衰寧膠囊中含有大量的大黃,若大量服用常引起腹瀉。同時,研究發現補充益生菌可減少腎病患者條件致病菌、增加腸道有益菌,減少腸源性內毒素的釋放,進而有效改善腎功能水平,抑制患者全身的微炎癥狀態,延緩腎功能惡化進程[5]。復合乳酸菌腸溶膠囊(Lactic Acid Bacteria Complex Enteric Capsules,LCC)由鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株)、屎腸球菌和鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)3種益生菌復合而成,為了緩解腎衰寧膠囊的不良反應,并基于腸-腎軸理論[6],將復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)與小劑量的腎衰寧膠囊聯用,進一步尋找腎纖維化治療的新方法。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物SPF級雄性Wistar大鼠,4～8周齡,體重160～180 g,購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2018-0006]。所有動物飼養條件和動物實驗都嚴格地遵循南京中醫藥大學倫理委員會的規章和制度[倫理審查證書編號:202104A005]。動物適應性喂養7 d后,進行UUO手術模型的建立,給予自由飲水和攝食并保持晝夜規律,動物房溫度維持在(22±2)℃[實驗動物使用許可證號:SYXK(蘇)2018-0049]。

1.2 藥品與試劑腎衰寧膠囊(批號:20200515,云南雷允上理想藥業有限公司);復合乳酸菌腸溶膠囊(批號:230105,江蘇美通制藥有限公司)。

溴甲酚紫平皿計數瓊脂培養基(BCP,青島海博生物科技有限公司);4%(V/V)頭孢菌素(CEX)BCP培養基,稱取頭孢氨芐250 mg溶于50 mL注射用水中,每100 mL BCP培養基中加入經0.22 μm濾膜過濾的頭孢氨芐混懸液4 mL;2.5%(V/V)四環素BCP培養基,稱取四環素(TC)40 mg溶于100 mL注射用水中,每100 mL BCP培養基中加入經0.22 μm濾膜過濾的四環素混懸液2.5 mL;API50CH生化鑒定試劑盒(生物梅里埃公司);蘇木素伊紅(HE)染色液、Masson染色劑[愛必信(上海)生物科技有限公司];尿素氮檢測試劑盒、肌酐檢測試劑盒、大鼠D-乳酸試劑盒、大鼠內毒素試劑盒、大鼠DAO試劑盒(南京建成生物科技有限公司);大鼠尿微量白蛋白(MAU)ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠TGF-β ELISA試劑盒、大鼠C-反應蛋白(CRP) ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司);α-SMA一抗、Col1A一抗,HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、Fluorescein(FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(武漢三鷹生物科技有限公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit,SYBR?Green PCR Core Reagents Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器設備XS105分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);SLT-700恒溫箱(日本EYELA公司); L535R 低溫離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);BX51顯微成像系統、倒置顯微鏡(日本Olympus公司);AII級生物安全柜(美國Thermo公司);RT-PCR儀(大連大龍生物科技有限公司);q-PCR儀、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)含量測定及生化鑒定取LCC 10 g,加無菌生理鹽水至100 mL,搖勻制成混懸液,作為1∶10供試液。取1∶10供試液1 mL,10倍系列稀釋成1∶102、1∶103等梯度。取相應稀釋級1 mL至平皿,加入培養基,每個梯度平行制備兩塊平皿,36 ℃培養72 h,瓊脂變為黃色的菌落即為乳酸菌,取菌落數在30～300 cfu之間的稀釋級計數。

乳酸菌總數(cfu·g-1)=BCP培養基中活菌數;鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株)活菌數(cfu·g-1)=含CEX的BCP培養基中活菌數;屎腸球菌活菌數(cfu·g-1)=含TC的BCP培養基中活菌數;鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)活菌數(cfu·g-1)=活乳酸菌總數-[含CEX的BCP培養基中活菌數+含TC的BCP培養基中活菌數]。

自含量測定項下BCP培養基、含CEX的BCP培養基和含TC的BCP培養基中,分別挑取數個單菌落,劃線接種于MRS瓊脂培養基平皿,36 ℃培養48 h,用API50CH生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。

2.2 單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型的建立大鼠適應性飼養7 d后分組,進行麻醉,打開左側腹腔,使用6-0手術線對左腎的輸尿管進行2次結扎,建立UUO模型。

從造模后第1天開始,每天1次灌胃給藥,分別給予1.5、3、6 g·kg-1腎衰寧膠囊(SSN,使用蒸餾水溶解不同濃度的腎衰寧膠囊)以及3 g·kg-1腎衰寧膠囊(SSN)和165 mg·kg-1復方乳酸菌腸溶膠囊(LCC)聯合使用,假手術組給予同等體積的蒸餾水,給藥第21天處理動物。

2.3 血液、腎組織和腸組織收集處理方法末次給藥后,腹主動脈取血。解剖取腎組織及腸組織,稱重,并計算腎系數。腎系數(kidney coefficient)=腎重(mg)/體重(g)。剩余腎組織保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于其他指標的檢測。

2.4 H&E染色和Masson染色腎組織經4%甲醛溶液固定后,脫水,石蠟包埋,切成2 μm薄片,采用HE和Masson三色方法進行染色。HE染色檢查炎性評分情況。Masson染色檢測根據其膠原沉積程度給出藍色膠原占切片組織面積的百分比,用于統計分析。

2.5 尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)含量測定方法大鼠血液于4 ℃、3 000 r·min-1,離心30 min,取上層血清,使用南京建成生物公司的尿素氮和血肌酐試劑盒,按照尿素氮檢測試劑盒(脲酶法)說明書及肌酐檢測試劑盒(肌氨酸氧化酶法)說明書進行檢測和計算血清中尿素氮和肌酐的含量。

2.6 免疫組織化學染色根據文獻中IHC染色方法[7]檢測腎臟組織中的Col1A和α-SMA分布和表達,并使用顯微鏡觀察,拍照,并用Image J軟件半定量測定陽性染色面積,計算陽性染色百分比進行統計學分析。

2.7 MAU、IL-6、TNF-α、TGF-β和CRP的含量檢測收集大鼠第20天24 h的尿液(收集前禁食禁水8 h),用于尿微量白蛋白(MAU)檢測。

將腎組織4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,按照白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)和C反應蛋白(CRP)的ELISA試劑盒說明書進行檢測。

2.8 D-乳酸、內毒素和二胺氧化酶(DAO)的含量檢測大鼠血液于4 ℃、3 000 r·min-1離心30 min,取上層血清,使用南京建成生物公司的D-乳酸、內毒素和二胺氧化酶(DAO)試劑盒,按照D-乳酸檢測試劑盒(比色法)說明書、內毒素檢測試劑盒(鱟試劑法)說明書和DAO檢測試劑盒(紫外比色法)進行檢測和計算血清中D-乳酸、內毒素和二胺氧化酶(DAO)的含量。

2.9 mRNA含量檢測按照文獻中mRNA檢測方法對腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1、Claudin-2 mRNA進行檢測[7]。

2.10 統計分析多個獨立的實驗結果均采用mean±SD表示,兩組間以Student′s t-test進行顯著性差異檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 乳酸菌含量、生化鑒定結果及復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)給藥劑量中活菌數根據乳酸菌計數實驗結果,每1 g內容物含活乳酸菌總數為2×107cfu·g-1,鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株)數為1×107cfu·g-1,屎腸球菌數為6×105cfu·g-1,鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)數為9×106cfu·g-1。

從3種培養基中挑取的菌落,通過API50CH生化鑒定試劑盒,分別鑒定出對應的鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株),屎腸球菌和鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)。

將大鼠給藥劑量165 mg·kg-1復方乳酸菌腸溶膠囊(LCC)換算成活菌計數,鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株)為1.3×106cfu·kg-1,屎腸球菌為7.9×104cfu·kg-1,鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)為1.2×106cfu·kg-1。

3.2 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)與腎衰寧膠囊(SSN)聯合治療對UUO大鼠腎功能的影響如圖1A和B所示,UUO模型組大鼠體重與假手術組比較,終末體重有明顯的下降,腎系數明顯升高,但給予不同劑量的腎衰寧膠囊其體重回調不明顯,只有高劑量(6 g·kg-1)腎衰寧膠囊(SSN)可以改善腎系數,而中劑量(3 g·kg-1)腎衰寧膠囊(SSN)與復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)聯合治療后,能明顯增加大鼠的體重(P<0.01)和腎系數(P<0.01),說明LCC能夠增加SSN對腎纖維的治療效果。

A.大鼠終末體重;B.腎系數;C.血清尿素氮(BUN);D.血肌酐(Scr);E.尿微量白蛋白(MAU)含量;SSN為腎衰寧膠囊;LCC為復合乳酸菌腸溶膠囊圖1 LCC聯合SSN治療對UUO大鼠腎功能的影響注:與模型(UUO)組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

如圖1C和D所示,模型組的尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)含量明顯高于假手術組;與模型組相比,SSN高劑量組可顯著降低BUN和Scr的含量(P<0.05),而低、中劑量卻無明顯作用,但LCC與中劑量(3 g·kg-1)SSN聯用后BUN和Scr明顯降低(P<0.05和P<0.01),表明LCC能夠增強SSN對腎功能的改善作用。

如圖1E所示,模型組大鼠尿液中的尿微量白蛋白(MAU)含量明顯高于假手術組;與模型組相比,LCC與中劑量(3 g·kg-1)SSN聯用和高劑量SSN單用一樣,都可顯著降低大鼠尿液中的MAU含量(P<0.01)。基于以上結果,說明LCC能夠增強SSN對腎纖維化的改善作用。

3.3 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)與腎衰寧膠囊(SSN)聯合治療能夠改善UUO大鼠腎纖維化大鼠腎組織HE染色結果如圖2A&E所示,UUO模型組腎小管萎縮,表現為上皮細胞變小,排列緊密,或管腔明顯擴張,上皮細胞低立方或扁平狀,腎小管腔內有透明管型。相比模型組,LCC與3 g·kg-1SSN聯用治療后大鼠腎組織的腎小管、腎小球、間質病變程度均顯著減輕(P<0.01)。

A.腎組織H&E染色切片(×200);B.腎組織Masson染色切片(×200);C.免疫熒光染色切片(α-SMA 100 μm);D.免疫熒光染色切片(Col1 100 μm);E.炎性評分;F.膠原沉積百分比;G.α-SMA蛋白半定量分析;H.Col1A蛋白半定量分析;SSN為腎衰寧膠囊;LCC為復合乳酸菌腸溶膠囊圖2 LCC聯合SSN治療對UUO大鼠腎纖維化的影響注:與模型(UUO)組相比,**P<0.01,***P<0.001。

大鼠腎組織Masson染色結果如圖2B&F所示。模型組大鼠腎盂黏膜下、髓質可見少量纖維組織增生,Masson染色呈藍綠色的纖維條索。相比模型組,LCC聯合3 g·kg-1SSN給藥組大鼠腎組織膠原沉積程度均顯著減輕(P<0.01)。

如圖2C～D、G～H所示,使用免疫組化的方法檢測了Col1A和α-SMA的蛋白表達,發現與假手術組相比,UUO模型組大鼠腎組織的Col1A和α-SMA蛋白含量明顯增加(P<0.001),3 g·kg-1SSN也能輕微減少α-SMA和Col1A蛋白表達,而LCC聯合3 g·kg-1SSN治療可顯著降低Col1A和α-SMA蛋白表達(P<0.01),說明LCC聯合SSN治療能夠改善腎輸尿管梗阻引起的腎纖維化相關蛋白的表達,減輕腎纖維化的程度。

3.4 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)聯合腎衰寧膠囊(SSN)治療對UUO大鼠的抗炎作用如圖3所示,與假手術組相比,模型組腎組織中的IL-6(見圖3A)、TNF-α(見圖3B)、TGF-β(見圖3D)和血漿中的CRP(見圖3C)都明顯升高,表明UUO模型中發生明顯炎癥反應;與模型組相比,LCC與SSN聯合治療,可顯著降低IL-6(P<0.01)、TNF-α(P<0.001)、CRP(P<0.01)和TGF-β(P<0.05)的含量,表明LCC與SSN聯用能明顯減輕炎癥相關因子的表達,起到良好的抗炎效果,其中TGF-β也是目前已知最強的促纖維化因子。因此上述結果說明,UUO模型大鼠腎組織的炎癥和纖維化程度明顯增加,而LCC能明顯增強SSN對UUO大鼠的抗炎和抗纖維化作用。

A.腎組織IL-6含量;B.TNF-α含量;C.血漿中CRP含量;D.腎組織TGF-β含量;SSN為腎衰寧膠囊,LCC為復合乳酸菌腸溶膠囊圖3 LCC聯合SSN治療對UUO大鼠炎性因子的影響注:與模型(UUO)組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3.5 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)聯合腎衰寧膠囊(SSN)治療明顯改善UUO大鼠的腸黏膜屏障功能表1數據顯示,UUO大鼠血清中的D-乳酸(D-LA)、內毒素和DAO的水平顯著升高,提示存在腸黏膜損傷。而在藥物干預組中,LCC與SSN聯用可顯著降低這3項指標(P<0.05),但SSN中劑量(3 g·kg-1)對指標的降低程度不及藥物聯用顯著,說明LCC能夠增強SSN對UUO大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用。

表1 各組腸黏膜屏障功能比較

3.6 復合乳酸菌腸溶膠囊(LCC)聯合腎衰寧膠囊(SSN)治療對UUO大鼠腸道緊密連接蛋白的影響采用Q-PCR對腸道mRNA進行檢測發現,與假手術組相比,UUO模型組ZO-1、Occludin及Claudin-1 mRNA表達量顯著降低,Claudin-2基因表達顯著升高,而經SSN低中劑量治療之后,其改善作用并不明顯,而與LCC聯用干預后,ZO-1、Occludin及Claudin-1 mRNA基因表達量均呈現出顯著上升趨勢,Claudin-2基因表達顯著降低(圖4A～D),說明LCC與SSN聯用能夠增強SSN對大鼠腸黏膜功能的改善作用。

A.ZO-1表達;B.Occludin表達;C.Claudin-1表達;D.Claudin-2mRNA表達;SSN為腎衰寧膠囊,LCC為復合乳酸菌腸溶膠囊圖4 LCC聯合SSN治療對UUO大鼠腸組織緊密連接蛋白的影響注:與模型(UUO)組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

4 討論

腎臟疾病是一種從腎炎循序漸進發展至腎臟纖維化最終發展成腎衰竭的疾病,到目前為止,對于腎衰竭、腎臟纖維化類腎臟疾病治療手段較為有限,當腎臟病發展到腎臟纖維化時,其對于機體是一個不可逆的過程,現代醫學主要治療手段僅有血液透析和器官移植,副作用較大且具有一定的局限性[7]。中藥復方腎衰寧膠囊是現階段較為成熟的治療腎功能不全類疾病的有效藥物之一,但基于大劑量可能引起腹瀉等不良反應,許多臨床研究使用西藥輔佐以腎衰寧膠囊聯用,以保證治療效果的穩定[8]。

有學者認為,腎病患者的腎小球濾過率下降會導致結腸聚集大量的尿酸和草酸鹽,導致腸道環境的改變,進一步加重腸道菌群紊亂。腸通透性增加可導致脂多糖持續滲透到門靜脈,導致代謝性內毒素血癥,并升高炎性細胞因子的水平,加速腎病的病程進展[9-11]。因此,腎病和腸道菌群失調可能互為因果,這種關系使機體處于惡性循環中。現就腸道菌群對腎病的影響將益生菌與腎衰寧膠囊聯用,以期為尋找治療腎病潛在方法提供依據。

復合乳酸菌腸溶膠囊由鼠李糖乳桿菌(Ⅰ株)、屎腸球菌和鼠李糖乳桿菌(Ⅱ株)3種益生菌復合而成,鼠李糖乳桿菌依附于宿主的腸上皮細胞,能夠成為腸道黏膜的一層生物屏障,從而達到提升宿主腸道黏膜屏障能力,減少過敏原對腸黏膜的刺激、減輕炎癥反應,從而提升機體免疫力;還可以預防和治療腹瀉。屎腸球菌也可在腸道上皮細胞上形成生物膜,保護腸上皮細胞免受有害物質侵襲,對假單孢菌、沙門菌及志賀氏菌有較好的抑制作用。所以,實驗中將復合乳酸菌與腎衰寧膠囊聯用,發現腎小球濾過功能相關指標尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)[12],及腎功能相關指標尿微量白蛋白(MAU)[13]都比腎衰寧膠囊單用的藥效明顯,并對腎纖維化大鼠的腸道黏膜損傷的血清標志物DAO、D-LA及內毒素[14]進行了檢測,發現藥物聯用也能顯著改善腸黏膜屏障功能。同時,Occludin及Claudin-1作為跨膜蛋白,ZO-1為外周膜支架蛋白,皆為腸道緊密連接不可或缺的重要組成部分[15],將腎纖維化大鼠給予藥物聯合作用后,發現腸道緊密連接蛋白都趨于正常。對腎組織進一步檢測發現,LCC和SSN聯合治療也降低了腎組織中IL-6、TNF-α等炎癥因子[16]的表達及膠原等纖維化基質的蓄積。本文從平衡腸道微環境,保護腸黏膜屏障功能,維持腸道菌群穩態出發,進而減輕炎癥反應,抑制腎纖維化的進一步惡化,同時減輕了大量使用藥物對機體帶來的副作用,為今后中藥聯合益生菌預防和治療腎病提供更多方向。