中藥蟾酥的質量研究現狀

石麗,焦陽,薛菲,陳娟,汪冰,林永強

(1.山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局膠類產品質量評價重點實驗室,中藥標準創新與質量評價山東省工程研究中心,中藥配方顆粒共性技術山東省工程研究中心,產業技術公共服務平臺,山東 濟南 250101;2.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355)

蟾酥是蟾蜍科動物中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的耳后腺和皮膚腺體的干燥分泌物。多于夏、秋二季捕捉蟾蜍,洗凈,擠取耳后腺和皮膚腺的白色漿液,加工,干燥而成,主產于河北、山東、四川等省。蟾酥甘辛、溫,有毒[1],入心、胃、腎三經,具有解毒消腫,止痛,辟穢濁的功效[2-3],臨床常用于瘡癰腫毒、咽喉腫痛、暑天飲食不潔所致吐瀉腹痛等[4]。屬我國傳統名貴動物藥品種,也是國務院頒布的需要特殊管理的28種毒性中藥品種之一,從《中國藥典》1963年版開始,歷版《中國藥典》均有收載。

近年來,國家對中藥質量要求不斷提高,伴隨著檢測技術的進步,以及對藥材研究的深入,蟾酥藥材質量標準不斷提高,更有利于加強對藥材質量的控制。但由于蟾酥在臨床上應用廣泛、藥物劑型多樣,加之蟾酥自然資源有限,使得藥材價格一路攀升,導致商品蟾酥品種基原混雜,摻雜、摻假現象時有發生,針對現有的研究情況,本文對近年來蟾酥藥材質量研究情況進行綜述。

1 蟾酥藥材概況

蟾酥始載于唐代甄權所著的《藥性論》,原名蟾蜍眉脂。首次以“蟾酥”記載于北宋寇宗奭所撰《本草衍義》的蝦麻項下,云:“多在人家渠塹下,大腹,品類中最大者是。遇陰雨或昏夜即出食。取眉間有白汁,謂之蟾酥。 以油單裹眉裂之,酥出單上,入藥用。有人病齒縫中血,以紙仟子蘸干蟾酥于血出處,按之立止。”明代陳嘉謨所著《本草蒙筌》:“眉間白汁,乃名蟾酥。刺取之時,先防射目。(沾之即瞎)。”以上記載的蟾酥采制方法與現今蟾酥一致。

明清時期有多部古籍記載蟾酥的藥理作用。《本草正》:“味辛麻,性熱,有毒。主治發背癰疽疔腫一切惡毒。若治風蟲牙痛,及齒縫出血,以紙捻蘸少許點齒縫中,按之即止。”《本草綱目》:“治發背疔瘡,一切惡腫。”《醫學入門》:“主治疽疔腫瘰疬,一切惡瘡頑癬。”《本草匯言》:“蟾酥,療疳積,消臌脹,解疔毒之藥也。能化解一切瘀郁壅滯諸疾,如積毒、積塊、積脹、內疔癰腫之證,有攻毒拔毒之功也。”《本草征要》:“蟾酥,味辛、性溫,有毒。入胃、腎二經。發背疔疽,五疳羸弱,立止牙疼,善扶陽事。”還有像《本草備要》《本草分經》《赤水玄珠》《本草求真》《本草便讀》等。到現代,《中藥大辭典》載:“蟾酥,性味辛、涼、有毒,能破癮結,行水濕,化毒,殺蟲,定痛。 治療瘡、發背、陰疽瘰疬,惡瘡,癥瘕積聚,鼓脹,水腫,小兒疳積,慢性氣管炎。”以上記載,均體現了蟾酥消腫、止痛、止血等的功效,這與蟾酥現代藥理學研究結果一致,現代藥理學還研究了蟾酥強心、抗癌、局麻等的功效。

2 影響蟾酥質量的因素

蟾酥質量受到多種因素的影響,包括品種基原、加工方式及炮制方法等,致使商品蟾酥質量差異較大,這些問題給蟾酥的質量控制帶來很大的挑戰。目前對蟾酥質量的研究主要集中于不同品種及不同資源分布地區蟾酥質量差異、蟾酥采集后初加工方式和不同炮制方式的影響。

2.1 品種蟾酥在歷代古籍及現代書籍中有多個別名。其最初記載名為“蟾酥眉脂”,又名蟾蜍眉酥,《本草衍義》方有“蟾酥”之名。到現代有蛤蟆漿、蛤蟆酥等俗稱。這與蟾酥產地眾多有關。歷代古籍中,《神農本草經疏》:“蟾蜍、蝦蟆,本是二物。經云:一名蟾蜍者,蓋古人通稱蟾為蝦蟆耳。經文雖名蝦蟆,其用實則蟾蜍也。今世所用者皆蟾蜍,而非蝦蟆,其功益可見矣。”又有《本草品匯精言》《紹興本草》等古籍中所提及蝦膜今指蛤蟆,即蛙。到了現代《中國藥典》規定其來源是中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)。

據文獻及資料調查,蟾蜍分布廣泛,世界各地均有分布。由中國科學院昆明動物研究所所創辦的中國兩棲類(www.amphibiachina.org)網站,已收載中國兩棲類物種596種(截至2022年4月17日)。其中,蟾蜍科品種眾多,總共記載有6屬20多種,包括蟾蜍屬、頭棱蟾屬、花蟾屬、小蟾屬、棱頂蟾屬、漠蟾屬。中華大蟾蜍(Bufogargarizans),俗稱癩蛤蟆,屬于兩棲綱,無尾目,蟾蜍科,蟾蜍屬。黑眶蟾蜍(Duttaphrynusmelanostictu)屬于兩棲綱,無尾目,蟾蜍科,頭棱蟾屬。目前市場上常見的花背蟾蜍(Strauchbuforaddei)屬于蟾蜍科,花蟾屬。除了分布最廣的中華大蟾蜍、黑眶蟾蜍及花背蟾蜍之外,蟾蜍屬還記載有10種,頭棱蟾屬有3種。而大多數文獻及資料現在將黑眶蟾蜍劃分在蟾蜍屬下,查閱中國動物主題數據庫,也只精確到蟾蜍科。所以關于黑眶蟾蜍的種屬問題有待進一步明確。加上現在蟾酥藥源的緊缺,以及中華大蟾蜍棲息地逐漸減少和人為亂捕濫殺,市場上流通的品種多樣,一些非藥典品種像花背蟾蜍、華西蟾蜍等,也在市場上流通。

早在1992年,金向群等[5]對中華大蟾蜍、黑眶蟾蜍、花背蟾蜍、華西蟾蜍4種動物的耳后腺分泌物,用薄層層析法測定其中蟾毒配基類化合物的含量,發現中華大蟾蜍耳后腺分泌物中蟾毒配基類化合物含量較高,華西蟾蜍耳后腺分泌物未檢出華蟾毒精,但其他幾種蟾毒配基類化合物含量均較高。繆珠雷等[6]對不同蟾蜍品種來源的蟾酥華蟾酥毒基和脂蟾毒配基進行測定,發現中華大蟾蜍、花背蟾蜍、華西蟾蜍含量呈現一定變化,但這種差異尚不明確是否由品種不同導致。張屏[7]對不同基原蟾酥類的HPLC指紋圖譜研究中,得到中華蟾酥、黑眶蟾酥、華西蟾酥、花背蟾酥的HPLC指紋圖譜,從分析技術上澄清了混亂品種。

2.2 產地有很多研究顯示,不同產地蟾酥主要成分差異顯著。在這些研究中,樣品產地溯源和物種鑒定中存在一些問題,所檢測蟾毒配基類成分不一。劉小英等[8]使用購買的黑眶蟾酥成品,作為不同產地的蟾酥樣品,檢測日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙毒精、華蟾毒配基和脂蟾毒配基的含量。毛佩芝等[9]使用公司提供的10個產地來源的中華大蟾蜍漿液新鮮冷凍樣品,檢測日蟾毒它靈、蟾毒他靈、遠華蟾蜍精、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾毒配基和脂蟾毒配基的含量。繆珠雷等[7]使用公司提供的蟾蜍漿液(采集和收購過程有專人現場監督),自行制成成品蟾酥,測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。還有研究結合指紋圖譜技術,對不同產地的蟾酥樣品進行研究,建立指紋圖譜。成小蘭等[10]使用10批不同產地的蟾酥藥材,建立蟾酥的HPLC指紋圖譜,不同批次蟾酥樣品相似度均較高。

產地造成蟾酥質量差異的原因可能是不同地區氣候因素差異導致蟾毒配基成分生物合成的變化。另外,蟾酥產地初步鑒別的特征性成分可以進一步尋找,以便更好地區分不同產地的蟾酥樣品,需要注意的是為了避免市場流通對蟾酥來源的可能影響,所使用的樣品最好是從確定產地的蟾蜍中采集得到的。

2.3 采集和初加工蟾酥在采集和初加工過程中,可能會受到采漿方法和成酥制作過程的影響,對成品蟾酥的質量產生很大影響。刮漿時要注意掌握正確的刮漿部位,用夾子擠漿時動作要快、輕重要適宜,還要注意制取使用的工具,要做到取漿完畢后的蟾蜍仍能正常生長,以保護資源。如果操作過程不規范,都會影響到蟾酥的質量。漿液采集后的加工炮制工藝也是蟾酥質量優劣的關鍵,目前研究較多的影響因素是過濾和干燥方式。

蟾酥鮮漿采集后應先過濾后再進行加工,因為采集后的鮮漿中可能會摻雜著雜質,會使蟾酥外觀品質下降。目前的文獻研究[11-13],對過濾所需的銅篩的目數并不統一,這也有待進一步的規范。

目前蟾酥產地加工中采用的干燥方法較多,有陰干、曬干、冷凍干燥等。不同干燥方法對蟾酥外觀質量及化學成分含量產生較大影響,使得蟾酥質量和臨床療效產生較大差異。吳世福等[14]對蟾酥不同干燥方法進行比較研究,以水分含量和3種蟾毒配基類成分的含量為指標,檢測室內避光陰干、室內晾曬、室外曬干、45 ℃烘干、80 ℃烘干5種不同干燥方法對蟾酥質量的影響,發現室內避光陰干是最好的干燥方法。曲婷等[15]以5種吲哚生物堿和5種蟾毒配基的含量為指標,考察鮮蟾酥樣品 5種干燥方式:105 ℃烘干、80 ℃烘干、60 ℃烘干、60 ℃減壓干燥、冷凍干燥對蟾酥藥材的影響,通過對比發現冷凍干燥是最優的干燥方式。陳瀛瀾等[16]考察蟾酥鮮漿5種干燥炮制加工方式(日曬干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓風干燥、80 ℃鼓風干燥、冷凍干燥)前后化學成分及藥效變化,通過性狀、7種蟾毒配基類成分含量及腫瘤細胞抑制效果的對比,發現5種干燥方式產生的蟾酥樣品性狀及腫瘤細胞的抑制有差異,但對7種蟾毒配基類成分的影響不是很大,而冷凍干燥的蟾酥華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和大于其他的干燥方法。

2.4 炮制方式蟾酥有毒,臨床用藥多經炮制,蟾酥的現代炮制以酒制法為主流[17]。歷版《中國藥典》收載的蟾酥飲片均為蟾酥粉,亦稱酒蟾酥。地方炮制規范除收載酒蟾酥外,還收載了乳制蟾酥、制蟾酥、蟾酥片等[18]。不同地方的炮制方法在輔料和用量上會存在差異。因此,對蟾酥炮制工藝進行規范化研究,制定生產過程中的技術規范和標準,是保證成品質量,從而保障其臨床療效的前提。

曲婷等[16]對蟾酥藥材采用酒制和乳制兩種炮制方法制備相應的飲片,測定炮制品中5種吲哚生物堿和5種蟾毒配基的含量,發現酒制和乳制對蟾酥中這些成分的含量基本無影響。沈嘉茵等[17]采用HPLC法,以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量為評價指標,選擇市售白酒、牛奶、滑石粉作蟾酥炮制輔料以單因素和正交試驗考察炮制工藝,最終篩選出蟾酥酒炮的最佳工藝:加入兩倍量55%乙醇,在60 ℃炮制12 h,干燥,粉碎。袁旭江等[19]采用正交法優化蟾酥酒炮工藝,篩選出蟾酥酒炮最佳工藝為:乙醇濃度為55%,藥輔比為1∶2,在60 ℃炮制12 h。

3 蟾酥藥材質量控制技術

蟾酥缺乏平常藥材(或飲片)固有的外觀形態,不能依靠性狀鑒別區分。除了性狀鑒別、顯微鑒別等方法之外,還有一些現代分析技術,逐漸應用到蟾酥質量評價過程中。

3.1 HPLC指紋圖譜技術中藥指紋圖譜技術是一種綜合的、整體的鑒定手段,可較全面地反映藥材/飲片的化學成分以及特征峰面積的相對比例,為蟾酥藥材的質量評估提供了一個綜合平臺。在指紋圖譜分析的基礎上,結合多元統計分析進行化學模式識別,可以呈現出指紋圖譜的異同,可在藥材/飲片質量、產地等的判別中克服主觀因素,更加準確地對藥材進行質量評價,應用廣泛[10,20]。

自《中國藥典》2000年版中修改含量測定用HPLC法后,針對蟾酥含量測定的研究逐漸增多。直到《中國藥典》2020年版在含量測定基礎之上,增加蟾酥特征圖譜的檢查。在此之前,張屏[7]對不同基原蟾酥樣品構建HPLC指紋圖譜,以15個不同產地的中華大蟾酥樣品構建13個共有峰的中華大蟾酥指紋圖譜,以5個不同產地的黑眶蟾酥樣品構建12個共有峰的黑眶蟾酥指紋圖譜。以3個不同產地的花背蟾酥樣品構建12個共有峰的花背蟾酥指紋圖譜,以3個不同產地的華西蟾酥樣品構建11個共有峰的華西蟾酥指紋圖譜,此外還包括一個岷山蟾酥和一個未定名蟾酥的指紋圖譜。朱玲英等[21]使用公司提供的10個蟾酥樣品,構建出10個共有峰的蟾酥藥材的指紋圖譜。張東紅等[22]對收集的18個不同產地的蟾酥鮮漿進行指紋圖譜研究,建立起12個共有峰的蟾酥鮮漿指紋圖譜。王鵬飛等[23]等對收集到的15批不同產地市售蟾酥樣品,用UPLC-QTOF-MS分析建立了蟾酥藥材的特征圖譜,10個共有峰包含了5個吲哚生物堿成分和5個蟾毒配基類成分。成小蘭等[10]收集10個不同產地的蟾酥樣品,建立了蟾酥的HPLC指紋圖譜,以10個色譜峰為指紋圖譜共有峰,對照品指認了3個主要色譜峰,結合主成分分析10個樣本聚為3類,反映出不同產地的蟾酥樣品之間也有差異,但沒有進一步尋找差異成分。房蘊歌等[24]對蟾酥藥材和飲片(蟾酥粉)的質量標準研究中,在前人研究的基礎上,對收集的38批不同產地的蟾酥藥材建立HPLC特征圖譜,以5個蟾毒配基類成分作為特征峰。同時也有一些針對蟾酥制劑的指紋圖譜研究[25-28]。

不難發現,這些研究的主要差別在于樣品,要收集足夠多、范圍足夠廣的樣品,使樣品更具代表性。問題在于:①從市場收集的樣品并沒有產地溯源;②沒有對樣品進行物種鑒定。所以結論不能和產地或物種進行良好的關聯,不利于蟾酥質量控制的整體研究。

3.2 一測多評王志民等[29]等提出的一測多評法解決了對照品缺乏和多指標檢測高昂的檢測成本的難題,實現對中藥的多成分質量控制。《中國藥典》2020年版蟾酥藥材的含量測定即采用一測多評法。在這之前,王鵬飛等[23]首先采用一測多評法對收集的15批不同產地的蟾酥樣品進行5種主要蟾毒配基的含量測定,以華蟾酥毒基為內參物,測定同類成分日蟾毒它靈,蟾毒它靈,蟾毒靈和脂蟾毒配基的含量。房蘊歌等[25]在前文分析的基礎上,細化分析相對校正因子的計算方法和計算波長,并進行驗證,最終確定納入標準正文的相對校正因子。還有研究運用一測多評法對蟾酥制劑進行含量測定[30-34],考察其可行性。

3.3 其他方法動物源性中藥中富含蛋白質、多肽等大分子物質,它們與植物藥材中小分子化合物有很大的不同,而動物源性中藥的正確使用對其應用、安全性和可持續性至關重要。蛋白質組學技術可以檢測鑒別中藥樣品中的特征蛋白,鑒別其來源、品種等[35-37]。房蘊歌[38]在以蟾酥為例探討“TOE”思路下的動物藥質量控制內涵研究中,對蟾酥中蛋白類成分進行研究,采用SDS-PAGE、NanoLC-MS/MS技術和生物信息學手段,對不同基原樣品的蛋白成分進行比較研究,并篩選基原間相互區分的生物標志物。王子月等[39]在基于納升液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜技術研究蟾酥鮮品中的蛋白質中,鑒定出407種蛋白質和880種多肽序列,并對蟾酥鮮品中的蛋白質組進行功能注釋及分類,發現這些蛋白涉及多種信號通路,為發現這些蛋白和其功能研究提供了實驗依據。

4 蟾酥藥材質量標準研究變革及現狀

自《中國藥典》1963年版收載蟾酥以來,后續各版藥典不斷提高完善。在地方標準中,蟾酥曾收載于臺灣1985版二冊、蒙藥1986版、新疆1980版二冊,現由于蟾酥統一執行藥典標準,地方標準已不再收載。表1羅列了各版藥典收載的項目以及變化情況。

表1 各版藥典收載情況及變化

蟾酥現行標準除《中國藥典》外,在香港特別行政區還需要符合《香港中藥材標準》[49](下文簡稱“港標”)中對蟾酥的質量要求。兩個標準執行適用的地域不同,收載的項目和限度也存有差異。現將《中國藥典》和《香港中藥材標準》的項目設置和細節的不同之處進行了對比,詳見表2。

表2 《中國藥典》和《香港中藥材標準》的項目對比

總體而言,蟾酥的質量標準經過50多年的變革,較之前有較大提升,與港標相比,質控思路和方法基本一致,細節多有不同,港標收載的檢查項目更加全面,藥典對部分項目的限度規定更加嚴格。

5 存在問題和展望

蟾酥化學成分復雜,目前關于其化學成分和藥理作用的研究越來越多。蟾酥制劑也廣泛地應用于抗炎、強心等方面,目前關于蟾酥抗癌作用的研究也越來越多。但中藥蟾酥的使用受限于品種基原、產地、加工方式等因素的影響,要想更好地應用到臨床上,質量控制的研究也是必不可少的。現行的蟾酥標準收載的質控項目已經較為完善,可以實現基本的質量控制,但是還未從根源上解決蟾酥的基原鑒別問題。蟾酥不易獲得,人工養殖受限,市場需求不斷擴大,不良商販在利益驅動下制假造假,為更好地進行藥材質量把控,必須要跟隨市場變化而不斷探索提高檢測水平,建立更全面、更易識別的蟾酥質量評價模式,有效提高蟾酥質量、保障臨床用藥安全。