間充質干細胞源性外泌體治療干眼的研究進展

張明杰,李從心,溫 瑩

0引言

干眼是一種慢性進行性疾病,常見癥狀包括眼干、眼紅、眼痛、異物感和視物模糊,嚴重降低患者的生活質量,增加家庭和社會的經濟負擔,隨著干眼發病率的逐年攀升,已然成為一個不容忽視的公共衛生問題。干眼的主要特征是淚膜內穩態喪失并伴有眼部癥狀,其中淚膜不穩定和高滲、眼表炎癥和損傷以及神經感覺異常是導致干眼的重要機制[1],因此,控制炎癥和免疫反應是預防和治療慢性干眼的基礎。當前治療干眼的手段主要包括人工淚液替代、抗炎、局部免疫抑制等藥物治療,但這些治療方法主要局限于改善眼表不適等癥狀,對于一些重度干眼患者的治療效果相對較差。近年來,隨著再生醫學的迅速發展,干細胞療法表現出對干眼的治療潛力。

干細胞可以分為成體干細胞和胚胎干細胞,其中間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是最重要的成體干細胞之一,具有自我更新和多向分化潛能[2],其良好的分化能力、體外擴增以及免疫調節特性使得MSCs在再生細胞治療中表現出巨大潛力。MSCs主要通過釋放外泌體(exosomes,Exos)介導細胞間通訊,相較于合成納米材料,Exos不但降低了藥物清除率,在靶向性、安全性和藥代動力學方面也更具有優勢[3],推動了納米載藥、基因工程等技術的發展,其作為一種新的無細胞治療策略逐漸受到研究者的關注。近年來的研究表明,間充質干細胞源性外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exos)在調節免疫反應等方面發揮重要作用,這為干眼的治療提供了新的方向。

1 MSCs及Exos概述

MSCs是從多種組織中分離出來的一種多能成體干細胞,具有自我更新能力和向成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞及其他類型細胞多向分化潛能[4]。因其相對簡單的細胞分離程序、自我更新和擴展的潛力、低免疫原性、多能性和分泌支持組織更新或替代的介質而逐漸成為最有前途的細胞治療工具之一。MSCs具有免疫調節潛能,可以調節固有和適應性免疫細胞,在受到炎癥因子刺激后通過細胞間的相互作用及產生細胞因子發揮免疫重建功能。然而,有報道表明MSCs在受損組織區域的存活率低,移植潛力低,注射可能導致腫瘤擴散,此外,MSCs分化可能導致動物模型組織骨化或鈣化[5],這在一定程度上限制了MSCs的有效性。

Exos這個術語最早于1981年由Trams等[6]提出,直徑40-100 nm,密度1.13-1.19 g/mL[7]。Exos是一種雙層脂質囊泡,產生于多囊體內,通過多囊體與質膜的融合釋放到細胞外環境[8],具有包括蛋白質、脂質、細胞表面受體、酶、細胞因子、轉錄因子和核酸[4]在內的多種信號分子,其擁有良好的生物相容性、穩定性、低毒性和分子交換能力,能夠跨越血腦屏障和血-眼屏障,通過多種途徑與靶細胞結合,將上述信號分子進行細胞間傳遞,實現遺傳信息交換、宿主細胞重編程和細胞通訊,從而達到藥物傳遞的目的[3],主要機制包括內吞作用、配體-受體結合或直接結合[9-11]。這些神奇的小囊泡在藥物傳遞、疾病診斷、細胞內通訊和生物標記物治療方面表現出的巨大潛力已逐漸成為當今醫學領域的研究熱點。

2 MSC-Exos的生物學功能及其制備

2.1MSC-Exos的生物學特性MSCs通過旁分泌途徑釋放Exos介導細胞間通訊,發揮免疫調節功能。MSC-Exos作為細胞間載體能夠將蛋白質、RNA等重要生物活性物質運送到靶細胞中達到特定疾病途徑的調控,顯示出其通過藥物傳遞治療多種疾病的巨大潛能[12],MSC-Exos保持其免疫原性低的優勢,無需擔心MSCs注射并發癥[13],降低了不良分化及成瘤的風險。此外,與它們的親代細胞相似,Exos的表面及內部可以被修飾,并可以在其表面附著各種靶向分子來提高MSC-Exos的靶向性,以顯示不同的抗體或表面受體,具有很強的擴展性[14]。這使得MSC-Exos在疾病治療方面比MSCs細胞治療風險更小,應用范圍更廣,已然成為無細胞治療的前途工具。因此,探究MSC-Exos在疾病中的作用及其機制有利于提升臨床疾病的診療水平。

2.2MSC-Exos的功能MSC-Exos具備分化、炎癥和免疫抑制等各種調節功能,在再生醫學領域的研究取得了很大進展。MSC-Exos的抗炎作用依賴于在炎癥免疫細胞(M1巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+Th1和Th17細胞)中傳遞免疫調節miRNAs和免疫調節蛋白,使其表型轉化為免疫抑制的M2巨噬細胞、耐受性樹突狀細胞和T調節細胞,有助于減輕炎癥反應并促進組織修復再生[15]。MSC-Exos通過調節免疫細胞、促炎因子和抗炎因子的比例以及與免疫應答相關的基因[16-17],在免疫抑制中發揮重要作用。

2.3MSC-Exos的制備MSC-Exos的現存分離技術主要包括超速離心分離技術、沉淀技術、免疫親和捕獲技術以及一些新的組合技術,其中通過超速離心技術所獲得的MSC-Exos 純度最高[18],該方法根據Exos的大小和密度分離,這種技術雖然耗時,但成本較低且安全可靠,通常用于從大量生物培養物中分離Exos。然而,當前各種方法都存在設備復雜、可擴展性、提取囊泡純度控制、污染控制等局限性,從臨床前研究到臨床,MSC-Exos在大規模體外生產、高質量收集、優化儲存條件等方面仍存在挑戰。因此,當前需要解決的主要問題是如何建立最佳的MSCs培養條件及Exos生產、分離和儲存的標準,以提供批間的一致性、最佳劑量和給藥時間表。

3 MSC-Exos在干眼治療中的作用及機制

干眼是眼科最常見的慢性眼表疾病之一,是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩定和高滲透壓的惡性循環,導致眼表炎癥、損傷和神經感覺異常,對患者的視覺功能、日常活動及生活質量都有顯著的影響[19]。在干眼治療中,MSC-Exos的治療目標是再生新的組織,以修復角膜、結膜和其他炎癥引起的損傷,并恢復淚膜的穩定性。Harrell等[20]通過對干眼患者使用人羊水來源MSCs(AF-MSCs)的滴眼液,顯著減輕了干眼患者的眼干、異物感、瘙癢感、疼痛、刺激、灼燒和眼疲勞,提示AFMSC-Exos在治療干眼中的治療潛力。以下將通過兩方面論述MSC-Exos對干眼治療作用的相關機制。

3.1MSC-Exos在炎癥方面對干眼的治療作用炎癥被認為是干眼的主要致病因素之一。眼表對環境因素、感染、內源性因素或抗原的應激反應被認為是干眼的觸發機制,從而啟動急性炎癥反應的信號通路,包括刺激促炎細胞因子、基質金屬蛋白酶(MMP)和趨化因子的產生[21],使得自身反應性輔助性T細胞擴張,從而浸潤眼表和淚腺,最終導致眼表的進一步損傷和一個自我持續的炎癥循環發展[22]。既往研究表明,干眼的長期炎癥可能導致白細胞介素(IL)-1、IL-6、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β水平的改變[23-27],其中IL-6在干眼中表達尤其高,IL-6與受體結合后,可激活磷酸化信號轉導,使Th17細胞分泌IL-17等炎癥因子[28],IL-17刺激MMP的表達,破壞角膜屏障,導致上皮細胞凋亡和杯狀細胞的丟失,從而加重炎癥和細胞凋亡。因此,控制炎癥是干眼治療的重要組成部分。

研究表明,Th1和Th17細胞同時存在于結膜杯狀細胞富集區,并伴有IFN-γ和IL-17的高表達[29],抑制IFN-γ能顯著減少杯狀細胞分泌的黏蛋白,抑制Th17細胞功能或靶向IL-17可以顯著降低干眼的嚴重程度并延緩其進展。研究發現,AF-MSCs可以產生高水平的IL-10以及免疫調節生長相關基因以減弱樹突細胞的成熟和抗原遞呈功能,抑制Th17的免疫應答[30],從而表現出免疫抑制的能力。AFMSC-Exos含有免疫抑制因子TGF-β和HGF,可以抑制T細胞增殖并減弱T細胞介導的炎癥。同樣,B細胞的成熟和增殖減少,其產生抗體的能力受到抑制,這表明AFMSC-Exos具有很強的免疫抑制潛能[31],證實了AFMSC-Exos作為一種潛在的炎癥性疾病治療新藥物的意義。

有研究證明脂肪間充質干細胞源性外泌體(ADSC-Exos) 可能通過抑制TLR4信號通路/NLRP3-IL-1β信號通路降低細胞因子從而對苯扎氯銨誘導的小鼠干眼具有顯著的治療作用[32-33]。李娟等[34]通過臍帶血MSC-Exos混懸液證明其能夠降低IL-6、IL-1β、TNF-α的轉錄,從而參與免疫系統和補體系統的調節,達到治療干眼的目的。李娜等[35]通過建立兔自身免疫性干眼模型證明人臍帶來源MSC-Exos可誘導外周血單核巨噬細胞向抗炎性M2表型分化,抑制TNF-α、IL-1β的表達分泌,同時升高TGF-β、IL-10 等表達,以達到減輕干眼角膜上皮損傷的目的。

3.2MSC-Exos在神經及組織修復方面對干眼的治療作用眼表感覺神經異常或淚腺功能異常可能引發干眼。角膜是眼前段最外層的透明結構,表面密布著感覺神經,眼表微環境變化信號到達神經中樞后,傳出神經支配刺激眼表腺體分泌和眨眼反射。角膜神經通過保護性眨眼反射和控制淚液分泌促進上皮生長以及局部免疫調節,構成了眼表微環境穩態的支柱,其功能異常會破壞眼表微環境,從而加重眼表損傷,導致干眼相關炎癥的持續性。此外,正常的結膜神經功能是調節杯狀細胞分泌和維持眼表功能的重要因素,結膜神經功能異常會導致杯狀細胞分泌減少,從而影響淚膜穩定性,加重眼表損傷。研究表明脂肪MSCs可以通過分泌神經生長因子、腦源性及膠質細胞源性神經營養因子抑制炎癥反應,支持周圍神經再生[36],局部應用MSC-Exos可以顯著增加杯狀細胞的數量和分泌的質量以治療干眼[37]。

淚液大部分由淚腺分泌,淚液分泌不足或成分異常及淚腺功能異常會引起干眼,從而出現眼部干澀、異物感、燒灼感等表現。淚腺來源MSC-Exos包含 Lcn2、prosaposin、Rac1和STAT1等蛋白,這些蛋白對淚腺上皮細胞存活產生積極影響,并可能誘導淚腺再生[38],體現MSC-Exos通過組織修復能力實現緩解干眼的目的。

總的來說,炎癥的惡性循環被認為是干眼的核心驅動因素,其眼表感覺神經元和局部免疫系統之間的雙向相互作用導致淚液高滲、角膜和結膜細胞凋亡,進而刺激神經沖動活動[39]。了解與干眼相關的基本免疫因素對于適當管理干眼患者至關重要,近年來研究表面MSC-Exos在炎癥反應、藥物傳遞、神經及組織方面顯示出具有巨大的潛力和可實用性,然而目前的研究大多建立在動物模型的基礎上,且制備困難,缺乏大樣本的臨床研究,包括給藥方式、劑量、治療時機、臨床試驗的安全性及有效性等也有待于進一步探索,這需要通過動物研究進一步驗證和評估,否則無法在臨床上發揮MSC-Exos的治療潛力。

4展望

MSC-Exos在細胞通訊和免疫調節方面起著重要作用,可以促進受損組織或細胞修復和再生、減輕炎癥及重建眼表穩態,作為藥物運輸載體在干眼治療中表現出廣闊的發展前景,然而其在人體內的生物分布、半衰期以及Exos與靶細胞溝通的分子機制等方面需要進一步明確,此外,MSC-Exos治療干眼尚缺乏與其他疾病模型進行對比研究的數據及相關臨床研究,以證實其在干眼治療中的有效性、安全性,MSC-Exos在其他眼科治療如葡萄膜炎、腫瘤性疾病等方面研究尚屬空白。同時,由于技術限制,難以獲得高純度、高得率的MSC-Exos,因此未來需要進一步對Exos的生物發生、細胞攝取和運輸等領域以及眼部其他疾病進行廣泛深入的研究。

近年來,隨著生物工程和細胞修飾技術的高速發展,Exos的下一步研究將是表面和內容物的工程或修飾,以應用到更加廣闊復雜的醫學領域。隨著研究思路與研究技術的不斷發展,MSC-Exos有望為干眼及其他眼部疾病的診斷與治療提供新策略,為此需要進一步探索優化上述問題,并促進未來Exos的功能研究。