凈制對烏梅質量的影響及烏梅肉質量標準的研究

楊琳琳 辛潔萍 張姝妍 王 鑫 譚景勻 王 璇 程水清 文 佳 徐新房 李向日

(北京中醫藥大學中藥炮制研究中心/中藥品質評價重點實驗室,北京,102488)

烏梅為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實,具有斂肺,澀腸,生津,驅蛔的功效[1],主產于四川、福建、云南等[2]。其化學成分包括枸櫞酸等有機酸類成分等[3],具有抑菌、調節腸道菌群等多種藥理作用[4]。

烏梅的凈制最早出現在漢代《傷寒論》中[5]。研究表明烏梅肉中枸櫞酸的含量明顯高于烏梅[6]。王貴林和張昊[7]比較烏梅、烏梅肉、烏梅核對豚鼠離體膽囊平滑肌作用后發現烏梅肉對膽囊的松弛作用較強。為保證臨床用藥安全有效,需要研究凈制對烏梅質量的影響。

烏梅肉臨床應用廣泛，如《傷寒論》中經典名方烏梅丸，方中大量使用烏梅肉為君藥[8]。中藥的質量是影響臨床用藥的關鍵[9]。《中華人民共和國藥典》2020年版收載了烏梅、烏梅肉和烏梅炭3種飲片規格，其中，烏梅肉項僅對炮制方法進行了規定，其他質量標準項缺失。在地方炮制規范中，僅《山東省中藥飲片炮制規范·2012版》[10]對烏梅肉有較詳細的測定，但未規定含量測定項。標準中烏梅肉部分質量標準項缺失、地方炮制規范限度指標是否合理等問題嚴重影響烏梅肉的質量控制，亟須規范烏梅肉的質量標準，以保證臨床烏梅肉飲片質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 檢測器2489(型號:UV/Vis Detector)、進樣器(型號:Alliance 2695),高效液相色譜儀(沃特世公司,美國,型號:Waters-e2695)、色譜柱(Agilent公司,美國,型號:Agilent Zorbax SB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm),顯微鏡(奧林巴斯公司,日本,型號:BX51),FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司,型號:DFT-100),十萬分之一電子天平(賽多利斯儀器系統公司,德國,型號:SARTORIUS BS110S),電子天平(上海越平科學儀器有限公司,型號:FA1104),電熱鼓風干燥箱(常州諾基儀器有限公司,型號:DHG-9070A)、超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號:SB25-12DTDN),數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ-600DE)。

1.2 試藥 乙腈[色譜級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:387L-25962U]、磷酸[色譜級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:218128]、磷酸二氫銨(分析純,北京化工廠,批號:20110111)、枸櫞酸對照品(含量99.7%,中國食品藥品檢定研究院,批號:100396-202104)、熊果酸對照品(含量99.9%,中國食品藥品檢定研究院,批號:110742-201823)、烏梅對照藥材(中國食品藥品檢定研究院,批號:121208-201707)、娃哈哈礦泉水(杭州娃哈哈集團有限公司,批號:3121GH)。

1.3 樣品信息 12批烏梅樣品經北京中醫藥大學李向日教授鑒定,均為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實。21批烏梅肉,其中12批為烏梅樣品蒸制所得各批次烏梅肉;其余9批來源于亳州市滬譙藥業有限公司和亳州中藥材市場,經北京中醫藥大學李向日教授鑒定為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實的果肉。樣品信息見表1。

表1 烏梅肉樣品信息及外觀性狀

2 方法與結果

2.1 烏梅2種凈制方法的比較研究

2.1.1 蒸制時間的考察 取WM0101 250 g,置于蒸鍋內平鋪一層,查看不同蒸制時間烏梅的軟化程度。蒸制20 min時,樣品基本軟化,但隨著剝肉時間的推移,未凈制的樣品開始發硬,不易剝取;30 min時所得軟化藥材易于剝取;到40 min時,部分樣品果肉成泥狀,軟化過度。故實驗采用了蒸制30 min進行軟化。

2.1.2 潤制時間的考察 取WM0101 250 g,用潤濕的紗布包裹好,平鋪一層放于搪瓷盤內潤制,并隨時查看烏梅的潤制程度,確定潤制時間。烏梅潤制時間較長,6 h時仍無法剝取,故潤制時間定為潤制過夜,所得樣品易于剝取,無破爛。

2.1.3 凈制 蒸法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,置于蒸鍋內平鋪一層,蒸制30 min,取出,趁軟剝肉,置50 ℃烘箱內烘干,即得。見圖1。產率見表2。潤法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,用潤濕的紗布包裹好,平鋪一層放于搪瓷盤內至潤透,取出,剝肉,置50 ℃烘箱內烘干,即得。見圖1。產率見表2。

圖1 烏梅肉

表2 烏梅肉2種凈制方法的比較(%)

2.1.4 水分 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水分測定法第二法測定。見表2。

2.1.5 浸出物 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定。見表2。

2.1.6 枸櫞酸含量測定

2.1.6.1 提取次數的考察 取WM0101-R,依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項下供試品溶液制備方法,制備提取1次、2次的供試品溶液,依照高效液相色譜法測定。烏梅肉中枸櫞酸提取次數的考察結果見表3。

表3 烏梅肉中枸櫞酸提取次數(%)

結果表明第1次提取所得枸櫞酸含量小于第1次提取所得枸櫞酸含量的5%,說明提取完全。

2.1.6.2 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項下高效液相色譜法測定。枸櫞酸高效液相色譜圖、蒸烏梅肉色譜圖見和潤烏梅肉高效液相色譜圖見圖2。枸櫞酸含量測定結果見表2。烏梅肉樣品色譜峰面積與枸櫞酸對照品的面積比為1～1.5∶1,因此《中華人民共和國藥典》所載烏梅枸櫞酸檢測方法可用于烏梅肉中枸櫞酸的檢測。

圖2 烏梅肉樣品和對照品高效液相色譜圖

2.2 凈制對烏梅質量的影響

2.2.1 烏梅樣品的凈制 蒸法:取凈烏梅,置于蒸鍋內,蒸制30 min取出,趁軟剝肉,置50 ℃烘箱內烘干,即得。見圖3。烏梅不同部位產率見表4。

圖3 烏梅、烏梅核及烏梅肉樣品

表4 烏梅不同部位的產率(%)

2.2.2 水分 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水分測定法第二法測定。烏梅各部位水分見表5。

表5 烏梅不同部位浸出物及枸櫞酸含量測定結果(%)

2.2.3 浸出物 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定。烏梅各部位浸出物結果見表5。

2.2.4 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項下高效液相色譜法測定。烏梅各部位高效液相色譜圖見圖4,枸櫞酸含量見表5。

圖4 烏梅不同部位高效液相色譜圖

本實驗采用蒸法對烏梅進行軟化,剝肉,各部位占比見圖5。烏梅肉的平均占比為35.9%,烏梅核的平均占比為56.8%。因此,為保證臨床用藥劑量的準確性,去核是非常有必要的。與烏梅飲片比較,烏梅肉和烏梅核在浸出物以及枸櫞酸的含量上比較差異有統計學意義(P<0.001)。與烏梅核比較,烏梅肉在浸出物以及枸櫞酸的含量上比較差異有統計學意義(P<0.001)。因此凈制去核是非常有必要的。見圖6。

圖5 烏梅肉產率

圖6 烏梅不同部位浸出物與枸櫞酸含量測定結果

2.3 烏梅肉質量標準的研究

2.3.1 性狀 對烏梅肉的色澤、氣味、質地進行描述、記錄。21批烏梅肉的性狀描述見表1,烏梅肉外表皮黑色或灰色,內部紅棕色,無核。味酸。

2.3.2 鑒別

2.3.2.1 顯微鑒別 取烏梅肉粉末(過二號篩),水合氯醛裝片后在顯微鏡下觀察。烏梅肉的顯微鑒定結果見圖7。非腺毛,單細胞,呈彎曲或鉤狀,包腔內含黃棕色物。果皮表皮細胞淡黃棕色,多角形,壁稍厚,部分有非腺毛或毛茸脫落后的痕跡。石細胞淡綠色或棕黃色,胞腔內含黃棕色物。纖維單個或成束,壁黃色,呈梭形。含螺紋導管、具緣紋孔導管。

圖7 烏梅肉顯微鑒定

2.3.2.2 薄層鑒別 取烏梅肉粉末2 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水20 mL使溶解,加乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘渣用石油醚(30～60 ℃)浸泡2次,每次15 mL(浸泡約2 min),傾去石油醚,殘渣加無水乙醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。另取烏梅對照藥材5 g,同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品,加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述3種溶液各1～2 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

烏梅肉薄層鑒別結果見圖8,在供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色斑點。

圖8 烏梅肉薄層鑒別

2.3.3 水分 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水分測定法第二法測定。21批烏梅肉的水分測定結果見表6。12批自制烏梅肉的平均水分為10.7%,9批市售烏梅肉的平均水分為12.0%,21批烏梅肉水分的平均含量為11.3%,標準差1.9%。其中WMR0109為異常值。去除異常值后,20批烏梅肉的平均水分含量為11.0%,標準差為1.4%。在20批水分平均值的基礎上加上其2倍的標準差,作為水分的限度標準,故將水分的標準擬定為:不得過13.0%。

表6 烏梅肉水分、浸出物、枸櫞酸含量測定結果(%)

2.3.4 浸出物 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定。21批烏梅肉的浸出物測定結果見表6。12批自制烏梅肉的平均浸出物為72.5%,9批市售烏梅肉的平均浸出物為71.3%,21批烏梅肉的平均浸出物含量為72.0%,標準差為3.4%。在21批浸出物平均值的基礎上減去其2倍的標準差,作為浸出物的限度標準,故將浸出物的限度標準擬定為:【浸出物】照水溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定,不得少于65.0%。

2.3.5 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項下高效液相色譜法測定。21批烏梅肉的枸櫞酸含量測定結果見表6。12批自制烏梅肉的平均枸櫞酸含量為33.1%,9批市售烏梅肉的枸櫞酸含量為34.8%,21批烏梅肉枸櫞酸平均含量為33.8%,標準差為4.5%。在21批枸櫞酸含量的平均值的基礎上減去其2倍的標準差,故將枸櫞酸的含量限度標準擬定為:【含量測定】同藥材,含枸櫞酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

2.3.6 小結

傳統的性狀鑒定方法具有直觀、快速的特點。烏梅肉是由烏梅去核而得,其外表皮黑色或灰色,內部紅棕色,無核。味酸。

在烏梅肉的顯微鑒別中,非腺毛單細胞,呈彎曲狀或作鉤狀,胞腔內含黃棕色物。石細胞淡綠色或棕黃色,胞腔內含黃棕色物。纖維單個或成束,壁黃色,呈梭形。含螺紋導管、具緣紋孔導管。果皮表皮細胞淡黃棕色,表面觀類多角形,壁稍厚,非腺毛或毛茸脫落后的痕跡多見。其中石細胞、纖維、導管和表皮細胞在顯微鏡下觀察到的數量較少,多數為非腺毛。

在薄層鑒別中,烏梅肉與烏梅對照藥材色譜和熊果酸對照品在薄層色譜的相應的位置上,顯相同顏色斑點,這與烏梅藥材的鑒別方法一致,但考慮到烏梅肉中熊果酸的含量高于烏梅,故在取樣量上進行了減少,以免供試品濃度過高,造成拖尾。

水分是中藥飲片在儲存過程保證質量的一項重要指標。水分過高,霉菌新陳代謝的作用增強,生長繁殖加快,易引起中藥飲片的蟲蛀、霉變。浸出物測定對于控制中藥材和飲片質量具有重要意義,尤其是對于有效成分不明確或者多類成分均具有藥效作用的中藥。對烏梅肉水溶性浸出物采用熱浸法測定,要求是不得少于40.0%。本實驗測得除去異常值WMR0109之外的20批烏梅肉水分的平均含量為11.0%,符合《中華人民共和國藥典》飲片水分通常不得過13.0%的要求,WMR0109的水分結果為17.2%,遠遠超過烏梅肉均值,該水分下烏梅肉極易發霉變質,去除異常值可以更好更貼合實際制定烏梅肉飲片標準。考慮到生產的實際情況,烏梅肉水分不得過13.0%。本實驗測得21批烏梅肉的水溶性浸出物平均值為72.0%,考慮到生產的實際情況,將烏梅肉浸出物照水溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定,不得少于65.0%。提高了烏梅肉水溶性浸出物的限度要求,以便更好控制烏梅肉質量。實驗測得21批烏梅肉枸櫞酸含量為33.8%。考慮到生產的實際情況,認為烏梅肉含枸櫞酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

3 討論

本實驗對烏梅蒸和潤的軟化時間進行考察。最后確定蒸法蒸制30 min,潤法潤制過夜,對烏梅樣品進行凈制得到烏梅肉。從產率、浸出物以及枸櫞酸含量等方面,比較了2020年版《中華人民共和國藥典》中收載烏梅肉蒸制、潤制2種凈制方法的差異,結果發現:二者并無顯著性差異。在凈制時間上,蒸法所用時間遠短于潤法,且潤法軟化時會存在部分飲片表面質地較硬,水分不易滲透的現象;凈制后的烘干采用50 ℃低溫烘干[11],在烘干時間上,蒸法與潤法沒有差別,故本實驗未將烘干時間納入考察范圍。因此本實驗后續選擇了蒸法對烏梅進行凈制。

烏梅凈制可以去除非藥用部位,提高枸櫞酸及浸出物含量。通過對烏梅的核和肉2個部位的浸出物以及枸櫞酸含量的比較,發現二者存在極顯著性差異,且烏梅樣品大小不一,果核的占比不同,為了保證臨床用藥的準確性,凈制是非常有必要的。對于凈制對烏梅質量的影響研究,本實驗僅基于浸出物及枸櫞酸含量進行研究,未對凈制過程中可能出現的其他化學成分傳遞與轉化規律進行研究,課題組后續將通過液質聯用技術研究不同凈制方法對烏梅化學成分的影響。在2020年版《中華人民共和國藥典》烏梅【含量測定】項下,所用粉末為最粗粉,即過一號篩,而實驗中所得一號篩粉末顆粒較大,尤其烏梅核占比較大,容易造成取樣不均勻,測定數據不準確,故實驗時采用二號篩粉末進行測定,建議《中華人民共和國藥典》烏梅【含量測定】項進行相應修改。

烏梅肉為斂肺澀腸常用藥[12-15],臨床應用廣泛,需求量大。其質量是影響臨床療效的關鍵,本實驗通過提高烏梅肉的水分、浸出物標準要求及增加含量測定限度,對烏梅肉質量標準進行完善,以期對市場上烏梅肉的質量進行控制,更好地保證臨床療效。烏梅肉較烏梅藥效物質含量明顯升高,更利于臨床療效的發揮,但市場上烏梅肉飲片并不廣泛流通,建議引起飲片生產企業和中醫臨床的重視,保證烏梅肉飲片的臨床供應,提高中醫臨床療效。

利益沖突聲明:無。