液相阻斷ELISA口蹄疫抗體檢測(cè)原理及技巧

文│孫賀 王國(guó)巖 王長(zhǎng)鵬 崔貞愛(ài) 孫曉萍 （吉林省永吉縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

謝曉巖 （吉林永吉經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)綜合服務(wù)中心）

口蹄疫是一種嚴(yán)重威脅（如豬、牛、羊等）偶蹄目動(dòng)物健康的一類傳染性動(dòng)物疫病，給豬牛羊等養(yǎng)殖場(chǎng)/戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？h級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室口蹄疫抗體檢測(cè)是我國(guó)基層動(dòng)物防疫部門(mén)防控口蹄疫的重要方法，準(zhǔn)確檢測(cè)出當(dāng)?shù)刎i牛等動(dòng)物的口蹄疫抗體水平，對(duì)預(yù)防和控制當(dāng)?shù)乜谔阋咭卟【哂兄匾闹笇?dǎo)作用和參考意義。

口蹄疫抗體ELISA檢測(cè)是縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室最復(fù)雜的檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)難度大，操作步驟多，試驗(yàn)原理難以理解。筆者力求用簡(jiǎn)單通俗的語(yǔ)言把該試驗(yàn)的原理闡述清晰，希望能夠?qū)V大同行有所幫助。

一、液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)的試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)原理

液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)的基本原理是將已知的抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面，然后利用酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的抗體或抗原與之孵育，再通過(guò)顯色物顯色，其顯色深淺與待測(cè)物質(zhì)的含量成正比或反比。上述是較學(xué)術(shù)的原理描述，對(duì)于剛接觸試驗(yàn)的人員較難理解，筆者按待檢樣品有或無(wú)抗體兩個(gè)情況分別講解各試驗(yàn)步驟中的試驗(yàn)原理。

1.試劑廠家提供的抗原和待檢血清中的抗體反應(yīng)。本檢測(cè)試驗(yàn)中提到的抗原都是指試劑廠家提供的凍干病毒抗原，在檢測(cè)試驗(yàn)中我們要先溶解，按照使用說(shuō)明書(shū)的稀釋比例稀釋后使用。這里的抗體是指待檢血清樣品中抗體和陽(yáng)性對(duì)照抗體。第一步我們把稀釋后的血清樣品和稀釋后的抗原先后加入U(xiǎn)型反應(yīng)孔里4℃過(guò)夜或者37℃溫育90分鐘，其原因就是為了抗原抗體充分反應(yīng)結(jié)合。我們分兩種情況來(lái)看，第一種情況是待檢血清樣品里有抗體（這里以樣品內(nèi)抗體含量足夠多為例），其結(jié)果是所有抗原和抗體結(jié)合，沒(méi)有了游離狀態(tài)的抗原（筆者把沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)稱之為游離狀態(tài)）。第二種情況是樣品里沒(méi)有抗體，那么抗原沒(méi)有被結(jié)合，反應(yīng)孔中存在加入游離狀態(tài)的抗原物質(zhì)。

2.抗原抗體混合液移到包被有兔抗的ELISA板上溫育反應(yīng)。試驗(yàn)中使用的包被板可以理解成這種反應(yīng)板上固定有另外一種能和抗原結(jié)合的抗體，這種抗體可結(jié)合第一步反應(yīng)中沒(méi)有被樣品抗體結(jié)合而剩下的抗原。這里繼續(xù)分待檢血清樣品是否有抗體來(lái)看其試驗(yàn)原理，第一種情況若樣品有抗體，這個(gè)反應(yīng)孔里由于第一步抗原和樣品抗體結(jié)合了沒(méi)有余下的抗原，就沒(méi)有抗原和包被板上抗體的結(jié)合，此時(shí)的“樣品抗體＋抗原”結(jié)合物處于游離狀態(tài)。第二種情況若樣品沒(méi)有抗體，由于第一步加入的抗原是游離狀態(tài)，該狀態(tài)下的抗原會(huì)和包被板上的抗體結(jié)合，此時(shí)的抗原和包被板上的抗體結(jié)合成“包被抗體＋抗原”結(jié)合物，并且該結(jié)合物是固定在反應(yīng)板上的狀態(tài)。溫育洗板后，有樣品抗體的反應(yīng)孔，由于“樣品抗體＋抗原”結(jié)合物是游離狀態(tài)，會(huì)被洗掉，反應(yīng)孔只留有包被抗體，相當(dāng)于空孔。沒(méi)有樣品抗體的反應(yīng)孔由于“包被抗體＋抗原”結(jié)合物呈固定狀態(tài)，不會(huì)因洗板過(guò)程而洗掉，依然留在包被板上。

3.加入豚鼠抗體工作液進(jìn)行溫育反應(yīng)。豚鼠抗體可以稱之為I號(hào)抗體，這個(gè)抗體也能和抗原結(jié)合。我們知道一個(gè)抗原可以結(jié)合多個(gè)抗體。在本步驟中，第一種情況若是待檢血清樣品有抗體，該反應(yīng)孔由于洗板操作會(huì)把所有游離狀態(tài)的“樣品抗體＋抗原”清洗掉，反應(yīng)孔里沒(méi)有抗原的存在，所以這一步?jīng)]有抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，此時(shí)加入的I號(hào)抗體處于游離狀態(tài)。第二種情況待檢血清樣品沒(méi)有抗體的反應(yīng)孔這一步會(huì)形成“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體”結(jié)合體，并且固定在反應(yīng)板上。通過(guò)洗板后有樣品抗體的反應(yīng)孔由于I號(hào)抗體是游離狀態(tài)會(huì)被洗掉，孔內(nèi)只有包被抗體；無(wú)樣品抗體的反應(yīng)孔則在反應(yīng)孔里固定了“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體”結(jié)合體。

4.加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液進(jìn)行溫育反應(yīng)。兔抗豚鼠IgGHRP工作液可以稱之為酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體。該步驟加入的酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體能與第三步加入的I號(hào)抗體特異性結(jié)合。第一種情況若待檢血清樣品有抗體，該反應(yīng)孔由于只有包被抗體的存在，所以本次加入的酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體也是不能發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而呈游離狀態(tài)。第二種情況若沒(méi)有樣品抗體，該反應(yīng)孔這一步會(huì)形成“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體＋酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體”的結(jié)合體，并且固定在反應(yīng)孔里。洗板后有樣品抗體的反應(yīng)孔由于加入的酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體呈游離狀態(tài)所以會(huì)被洗掉，孔內(nèi)依然只有包被抗體；無(wú)樣品抗體的反應(yīng)孔則在反應(yīng)板上固定了“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體＋酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體”的結(jié)合體。

5.加入TMB底物顯色。加入底物之所以會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)是由于第四步中的酶催化導(dǎo)致的。所以這一步待檢血清樣品中含有抗體的反應(yīng)孔中由于沒(méi)有催化酶，加入底物不會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)。待檢血清樣品中無(wú)抗體的反應(yīng)孔由于存在“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體＋酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體”的結(jié)合體，其中酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體所含的酶會(huì)使底物溶液變成藍(lán)色。此時(shí)我們?nèi)庋鬯?jiàn)深藍(lán)色反應(yīng)孔的樣品是沒(méi)有抗體，或者抗體效價(jià)較低。

6.加入終止液，終止反應(yīng)并在酶標(biāo)儀上讀取D450納米值。顯色反應(yīng)結(jié)束后加入終止液。終止液為強(qiáng)酸溶液，強(qiáng)酸會(huì)使顯色終止，并且將顯示出的藍(lán)色變成黃色。這一步依舊是有樣品抗體的反應(yīng)孔不發(fā)生顯色終止反應(yīng)。沒(méi)有樣品抗體的反應(yīng)孔發(fā)生顯色終止反應(yīng)。此時(shí)顯示黃色的反應(yīng)孔是抗體陰性孔。D450值表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，該值越高表示被吸收掉的光越多。由于無(wú)樣品抗體反應(yīng)孔中含有“包被抗體＋抗原＋I(xiàn)號(hào)抗體＋酶標(biāo)Ⅱ號(hào)抗體”結(jié)合物能夠催化TMB底物，形成可以吸收光的物質(zhì)，所以該反應(yīng)孔的D450納米值較高，反之有樣品抗體的反應(yīng)孔無(wú)酶標(biāo)抗體，不能催化底物形成吸光物質(zhì)，所以D450納米值較低。

上述內(nèi)容只是就有無(wú)樣品抗體兩個(gè)極限做的原理說(shuō)明，但實(shí)際檢測(cè)試驗(yàn)中需要檢驗(yàn)抗體效價(jià)，效價(jià)可以通俗地理解成抗體的多少。若某樣品含有的抗體足夠多，稀釋該樣品到1∶128后樣品中的抗體還能全部結(jié)合掉加入的抗原，那么說(shuō)明該樣品效價(jià)高，該牲畜口蹄疫抗體水平高。若是某個(gè)樣品在1∶128的稀釋倍數(shù)后，該樣品所含有的抗體數(shù)量無(wú)法完全結(jié)合掉加入的抗原，就會(huì)形成后續(xù)一系列的抗體抗原結(jié)合反應(yīng)，最終形成吸光物質(zhì)，D450納米值大于臨界值說(shuō)明該樣品中不含有抗體或含有的抗體較少，判定為該牲畜口蹄疫抗體水平低或者無(wú)抗體。

二、試驗(yàn)操作的實(shí)用技巧

1.批量定性檢測(cè)法。在縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大批量口蹄疫抗體水平檢測(cè)時(shí)，通常采取定性檢測(cè)法。這樣一塊96孔兔抗包被板可檢測(cè)80個(gè)樣品，能有效降低檢測(cè)成本，并且能大量降低試驗(yàn)人員的工作量。具體做法是先在96孔反應(yīng)板上稀釋樣品，對(duì)待檢樣品做64倍稀釋，即1份樣品加入63份PBST緩沖液體。該稀釋過(guò)程可以用1毫升容量的96孔深孔反應(yīng)板（試劑盒里不提供，筆者是另外單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)的深孔反應(yīng)板）。由于稀釋步驟越少越能保證稀釋效果，筆者采用較多的稀釋方法是先在容量為1毫升的96孔的反應(yīng)板上的前10列分別加入630微升PBST緩沖液，之后依次在每個(gè)孔里加入10微升待檢血清樣品。這樣會(huì)獲得64倍稀釋的待檢樣品。然后抽取50微升64倍稀釋樣品后加入50微升抗原，進(jìn)一步稀釋到128倍，若此時(shí)該樣品的D450納米值大于臨界值，說(shuō)明該樣品按說(shuō)明要求做最小稀釋倍數(shù)依然沒(méi)有足夠多的抗體，說(shuō)明該樣品抗體含量較少，抗體陰性，抗體檢測(cè)不合格。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)技巧。筆者認(rèn)為試驗(yàn)設(shè)計(jì)是關(guān)系整個(gè)試驗(yàn)的關(guān)鍵所在，特別是在大批量檢測(cè)任務(wù)中，如春秋防疫驗(yàn)收的試驗(yàn)過(guò)程中由幾百上千份樣品要進(jìn)行檢測(cè)，這時(shí)候的試驗(yàn)設(shè)計(jì)非常重要，如采樣單元采樣數(shù)量設(shè)計(jì)。不同的采樣單位如全縣每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的采樣結(jié)構(gòu)要盡量相同，如定下每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)30頭份豬血清，20頭份牛血清，那么每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)都要按照這個(gè)采樣任務(wù)進(jìn)行采樣。由于我們反應(yīng)板一行可以檢測(cè)10份，所以單畜種采樣數(shù)量盡量做到10的倍數(shù)。如10份，20份等，這樣做的好處是每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)相同畜種的待檢血清都能占滿反應(yīng)板的一行，這樣在后期核對(duì)結(jié)果、出具檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)都會(huì)容易很多。

3.抗原的使用技巧。口蹄疫病毒抗原在稀釋后保存溫度為-20℃，若是開(kāi)展的檢測(cè)數(shù)量少，不能一次用完，會(huì)出現(xiàn)因抗原反復(fù)凍融出現(xiàn)失活的情況，進(jìn)而造成試驗(yàn)結(jié)果不成立或者試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的情況。因此，筆者在每次開(kāi)新的病毒抗原時(shí)都是分成5等份，稀釋后的1毫升病毒抗原每份200微升寫(xiě)好標(biāo)簽放于帶有膠塞的安培瓶中置于-20℃冷凍保存，每次檢測(cè)領(lǐng)取一份，這樣可以很好地避免抗原反復(fù)凍融，保證后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室是我國(guó)基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)檢測(cè)單位，對(duì)我國(guó)動(dòng)物疫病防控具有重要的作用。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)員做好口蹄疫抗體檢測(cè)對(duì)預(yù)防和控制本地口蹄疫疫情具有重大作用。作為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員要善于總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，理解并且掌握檢驗(yàn)原理，力求把檢驗(yàn)檢測(cè)工作做到更好，為我國(guó)基層口蹄疫疫情防控貢獻(xiàn)自己的力量。