IDH1 基因在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HuCCT1 增殖與遷移中的作用及其初步機(jī)制

林美佳，雷宇清，葉洲杰，朱麗萍，王心睿，黃雄飛

1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，福建福州 350004；2國家衛(wèi)健委非人靈長類生育調(diào)節(jié)技術(shù)評價重點(diǎn)實驗室/福建省婦幼保健院，福建福州 350000；3福建醫(yī)科大學(xué)婦兒臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350004；4福建省兒童醫(yī)院心臟外科，福建福州 350011；5福建省婦幼保健院，福建福州 350001；6福建省兒童醫(yī)院，福建福州 350011；7福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院福建省婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心，福建福州 350001；8福建醫(yī)科大學(xué)消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實驗室，福建福州 350108

肝 內(nèi) 膽 管 癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA)是指位于肝內(nèi)二級膽管至最小膽管分支的被覆上皮及管周腺體發(fā)生的具有高度侵襲性的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的10%～20%[1]。近30 多年來，全球iCCA發(fā)病率和病死率皆呈上升趨勢，目前其治愈的首選是根治性手術(shù)，但因早期發(fā)現(xiàn)困難，僅約35%的患者具有手術(shù)治療的機(jī)會，5 年生存率＜20%[2-3]。近年來，iCCA的治療已逐漸從單純手術(shù)過渡到以手術(shù)為基石的多學(xué)科綜合治療模式；由于iCCA發(fā)病機(jī)制尚不明確，晚期患者從綜合治療中的獲益仍存在較多爭議[4]。

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，包含IDH1、IDH2 和IDH3三個同工酶。其中IDH1位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中，IDH2和IDH3位于線粒體中[5-6]。iCCA具有較高頻率的IDH1和IDH2基因突變[7-9]，其中IDH1基因突變更常見，發(fā)生率為4.5%～55.6%[8,10-14]。針對IDH1基因突變的靶向藥物治療iCCA的相關(guān)臨床試驗正在進(jìn)行[15]。晚期iCCA患者的藥物治療尚未出現(xiàn)突破性進(jìn)展，藥物的具體作用機(jī)制也不明確。有研究報道，IDH1可能通過誘導(dǎo)乙醛脫氫酶1的表達(dá)來促進(jìn)iCCA細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[16]。對IDH1基因參與調(diào)控的重要基因和信號通路的深入研究，將有助于開發(fā)更有效的iCCA靶向藥物。本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和生物信息學(xué)方法探討iCCA 細(xì)胞HuCCT1中IDH1基因的生物學(xué)功能及可能的分子機(jī)制，旨在為揭示IDH1 基因在iCCA 發(fā)病中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人iCCA 細(xì)胞系HuCCT1 購自河南商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。CRISPR基因敲除質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)保存于本實驗 室；RPMI 1640 培 養(yǎng) 基(8121083)、胎 牛 血 清(2138109RP)、 0.25% 胰 蛋 白 酶(2192619)、 Opti-MEM? (2120763) T4DNA Ligase(00276732)購自美國賽默飛世爾科技公司；Trizol(338110)購自美國賽默飛Ambion 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R323-01)、熒光定量PCR 試 劑 盒(Q511-02/03)、2xPhanta? Max Master Mix(P515-01/02/03)、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit(L/N 7E480H0)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；StbI3 感受態(tài)細(xì)胞(WD0443143)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒(FKRP9JT6 QT)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Puromycin(QLL-38-03A)購自法國InvivoGen 公司；Matrigengel 基底膜基質(zhì)(082704)購自上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(DP304)、DNA 純化回收試劑盒(DP214)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118)購自天根生化科技(北京)有限公司；IDH1 抗體(A13245)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；Wnt3a(AF8352)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)(AF0066)抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH、β-actin、E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HuCCT1 細(xì)胞使用含10% FBS 的RPMI 1640進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2，并保持一定的濕度。

1.2.2 向?qū)NA(guide RNA，gRNA)的合成與設(shè)計

利用CRISPR 設(shè)計網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/)針對IDH1 的基因序列(NM_001282386.1)第4 外顯子設(shè)計gRNA，在gRNA的上下游5'端分別加上Bbs Ⅰ酶切位點(diǎn)的黏性末端(CACC/AAAC)，由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成引物。引物序列為：上游5'-CAC CCATGACGACCTATGATGAT-3'；下游5'-AAACAT CATCATAGGTCGTCATGC-3'。

1.2.3 重組載體PX459-gRNA 的構(gòu)建 稀釋gRNA 上下游序列濃度至10 μmol/L，反應(yīng)體系為：gRNA-F 9 μl，gRNA-R 9 μl，10×PCR Buffer 2 μl。退火形成雙鏈，退 火 程 序 為：95 ℃ 10 min，85 ℃ 1 s，25 ℃1 min；降溫至4 ℃。用T4連接酶將退火產(chǎn)物與經(jīng)Bbs Ⅰ酶切并純化的PX458質(zhì)粒于22 ℃連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌StbI3感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含有氨芐青霉素的TB 固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，將菌液送至福州博尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 IDH1敲除細(xì)胞株的構(gòu)建 將HuCCT1細(xì)胞鋪入6孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合時，PEI轉(zhuǎn)染法將重組載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，pLEGFP-N1 質(zhì)粒作為陽性對照，轉(zhuǎn)染8 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。PX459攜帶嘌呤霉素抗性，轉(zhuǎn)染48 h 后，使用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為陰性對照。抽提敲除細(xì)胞基因組，目的片段PCR 擴(kuò)增測序鑒定基因敲除情況。根據(jù)人IDH1 基因的序列(NM_001282386.1)設(shè)計驗證引物，引物序列為：上游5'-ACGACCAAGTCACCAAGGA-3'；下游5'-CCTATT GTGCAGCCAGTGTT-3'。送至福州博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測序。有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞，挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR 擴(kuò)增測序再次驗證，5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit TA 克隆鑒定敲除株基因型，最后在mRNA和氨基酸水平驗證IDH1的表達(dá)情況。

1.2.5 qRT-PCR檢測 Trizol法提取對數(shù)生長期的細(xì)胞總RNA進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR檢測基因相對表達(dá)量，2-ΔΔCt法對 mRNA 的定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blotting 檢測細(xì)胞IDH1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9、Wnt3a和β-catenin 蛋白表達(dá)水平 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，蛋白裂解液促使細(xì)胞沉淀中的蛋白質(zhì)游離至上清中，吸取上清，蛋白上清與5×上樣緩沖液按照4∶1體積混合，96 ℃變性10 min，得到變性后的蛋白樣品。隨后上樣電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜10 min×3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜10 min×3 次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.7 CCK-8 細(xì)胞增殖實驗 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按2000 個細(xì)胞/孔接種于96 孔板，每組重復(fù)3 次。細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后加入含10% CCK-8 試劑的RPMI1640培養(yǎng)基，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度(OD)值，收集數(shù)據(jù)，根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.8 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化重懸，以1000個細(xì)胞/孔均勻鋪于6孔培養(yǎng)板，正常培養(yǎng)9～10 d，待細(xì)胞形成肉眼可見的細(xì)胞集落后，PBS清洗，甲醇固定30 min，0.4%結(jié)晶紫溶液染色后拍照并計算克隆形成數(shù)。

1.2.9 細(xì)胞劃痕實驗 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后吹打至單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/L，接種于12 孔板上，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞基本融合。棄去培養(yǎng)基，用10 μl無菌槍頭在孔板底部中央垂直劃線，PBS沖洗脫落細(xì)胞，分別于0、8 h進(jìn)行拍照，觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕距離-8 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.10 Transwell 遷移、侵襲實驗 (1)細(xì)胞遷移實驗：收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，Transwell 小室中各加入5×104個/孔的細(xì)胞及200 μl 1%FBS 培養(yǎng)基，小室外加入500 μl正常培養(yǎng)基。16 h后取出小室，甲醇固定30 min，0.4%結(jié)晶紫溶液染色，棉簽擦拭小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，自然風(fēng)干后拍照計數(shù)。(2)細(xì)胞侵襲實驗：使用加入Matrigengel 基底膜基質(zhì)的Transwell 小室，培養(yǎng)時間為48 h，其余操作同遷移實驗。

1.2.11 細(xì)胞周期檢測 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞各5×105個，在冰冷的PBS中洗滌一次，-20 °C、75%乙醇固定過夜。PBS 洗滌細(xì)胞后，加入核糖核酸酶(10 μg/ml)，室溫下用5 μg/ml 碘化丙啶染色30 min。用美國BD 公司的流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，用Modfit 軟件計算細(xì)胞周期分布。實驗重復(fù)3次。

1.2.12 RNA 抽提與轉(zhuǎn)錄組測序 收集HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞，每個樣品1×106個細(xì)胞，PBS 磷酸鹽緩沖液清洗2 次，離心取細(xì)胞沉淀，加入1 ml Trizol重懸裂解細(xì)胞，將樣品送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行RNA抽提、建庫測序。抽提完成的RNA 樣品使用NanoDrop 2000 測定核酸濃度，實驗組與對照組各重復(fù)3 次。Illumina 建庫試劑盒TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit 對質(zhì)檢合格的RNA 樣品進(jìn)行建庫，構(gòu)建好的文庫用 Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeq X Ten 測序儀進(jìn)行測序，產(chǎn)生150 bp的雙端數(shù)據(jù)。

1.2.13 差 異 表 達(dá) 基 因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 將得到的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(clean data)用于后續(xù)分析。使用軟件RSEM(http：//deweylab.github.io/RSEM/)分別對基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，獲得基因讀數(shù)(read counts)后，進(jìn)行樣本間基因的表達(dá)差異分析。使用edgeR 根據(jù)基因讀數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)水平計算，篩選條件為FDR≤0.01、差異倍數(shù)(fold-change，F(xiàn)C)log2|FC|＞2。篩選出DEGs。

1.2.14 DEGs 的GO 和KEGG 富集分析 得到DEG后，通過使用g：Profiler 和Goatools 的功能注釋工具對DEGs 進(jìn)行GO 注釋，并采用KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路富集分析，Bonferroni 校正的P≤0.05，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或通路。對差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達(dá)模式。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism9 進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IDH1基因敲除細(xì)胞株HuCCT1IDH1-/-的構(gòu)建 將PX459-sgRNA 載體轉(zhuǎn)染至HuCCT1 細(xì)胞，為檢測細(xì)胞敲除效率，抽提嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測序，在IDH1基因靶點(diǎn)序列出現(xiàn)套峰(圖1A)。無限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株，對單克隆細(xì)胞基因組DNA 再次驗證，結(jié)果顯示4 號單克隆在sgRNA 序列中插入1 個堿基導(dǎo)致細(xì)胞基因組移碼突變(圖1B)。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與HuCCT1 細(xì)胞比較，敲除細(xì)胞株IDH1 mRNA 表達(dá)水平明顯下降(P＜0.0001，圖1C)。Western blotting 結(jié)果顯示，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞IDH1 蛋白相對表達(dá)量明顯低于HuCCT1WT細(xì)胞(P＜0.0001，圖1D)。

2.2 IDH1基因敲除對HuCCT1細(xì)胞增殖的影響 與HuCCT1WT細(xì)胞比較，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的增殖和克隆形成數(shù)明顯減少(P＜0.05，圖2A、B)，阻滯在G2/M期細(xì)胞的比例明顯增大(P＜0.01，圖3A-B)，且調(diào)控G2/M 周期增殖相關(guān)基因Cyclin A2、Cyclin B1 和CDK1的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05，圖3C)。

圖3 IDH1敲除對HuCCT1細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of IDH1 knockout on cell cycle of HuCCT1 cells

2.3 IDH1基因敲除對HuCCT1遷移、侵襲能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響 與HuCCT1WT細(xì)胞比較，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的劃痕愈合率明顯降低(P＜0.01，圖4A)，遷移細(xì)胞數(shù)(P＜0.001)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P＜0.05，圖4B)明顯減少；RT-qPCR 檢 測 結(jié) 果 顯 示，HuCCT1IDH1-/-細(xì) 胞EMT 相關(guān)基因Vimentin 和MMP-9 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，編碼E-Cadherin的CDH1基因表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01，圖5A)；Western blotting 結(jié) 果 顯 示，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞中E-Cadherin 表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而N-Cadherin、Vimentin 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05，圖5B)。

圖4 IDH1敲除對HuCCT1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Fig.4 Effect of IDH1 knockout on the migratory and invasive ability of HuCCT1 cells

圖5 IDH1敲除對HuCCT1細(xì)胞EMT的影響Fig.5 Effect of IDH1 knockout on the EMT ability of HuCCT1 cells

2.4 HuCCT1 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果及生物信息學(xué)分析

2.4.1 DEGS分析 通過對HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，構(gòu)建DEGs的火山圖(圖6)。以差異倍數(shù)＞2 且P≤0.01 為篩選條件，共篩選DEGS1476個，包括上調(diào)基因563個，下調(diào)基因913個。對這兩組細(xì)胞之間的DEGs進(jìn)行分層聚類熱圖分析，結(jié)果顯示這兩組細(xì)胞明顯區(qū)分開(圖7)。

圖6 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT 細(xì)胞的差異表達(dá)基因火山圖Fig.6 Volcanic map of differentially expressed genes betweenHuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.4.2 GO 富集分析 對HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞進(jìn)行DEGs的GO功能分析，從基因生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)3 個功能類單獨(dú)進(jìn)行進(jìn)一步的分類與富集分析。在BP的差異基因主要富集外部封裝結(jié)構(gòu)組織、腎臟系統(tǒng)發(fā)育、牙齒發(fā)育與發(fā)育有關(guān)的功能；在CC的差異基因主要富集于含細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白、肌膜、高爾基內(nèi)腔、T-小管、細(xì)胞體膜等條目；在MF 的DEGs 則主要富集于信號受體激活劑活性、受體-配體活性、細(xì)胞因子活性、糖胺聚糖結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等(圖8)。

圖8 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT細(xì)胞的差異表達(dá)基因GO功能分類Fig.8 GO functional classification of differentially expressed genes between HuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.4.3 KEGG 信號通路富集分析 對HuCCT1WT與HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞DEGs 的KEGG 信號通路分類及富集分析結(jié)果顯示，顯著富集的信號通路有14 條(P≤0.05)，富集程度最高的前5個信號通路為有絲分裂 原-活 化 蛋 白 激 酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、Rap1 信號通路、Wnt 信號通路、Hippo信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路(圖9)。

圖9 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT 細(xì)胞的差異表達(dá)基因KEGG信號通路分類Fig.9 KEGG biological pathway classification of differentially expressed genes between HuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.5 Wnt 信號通路中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)情況 隨機(jī)選取KEGG 分析排名前3 位的與iCCA 密切相關(guān)的Wnt信號通路進(jìn)行驗證。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與HuCCT1WT細(xì)胞比較，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05，圖10)。

圖10 HuCCT1WT與HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的Wnt信號通路Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較(Western blotting)Fig.10 Comparison of the expression levels of Wnt3a, β-catenin in Wnt signaling pathway between HuCCT1WT and HuCCT1IDH1-/- cell(Western blotting)

3 討 論

IDH1 和IDH2 可催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸和NADPH，為細(xì)胞能量代謝和生物合成提供前體物質(zhì)[6]；且在葡萄糖感知通路、谷氨酰胺代謝、脂肪生成和細(xì)胞氧化還原等細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[5]。當(dāng)IDH1 和IDH2 基因發(fā)生突變時IDH 的酶活性也發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞中腫瘤代謝物2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid，2-HG)大量蓄積[7,17-19]，可引起嚴(yán)重的表觀遺傳調(diào)控紊亂和基因表達(dá)失調(diào)[7,20]，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。IDH1 是調(diào)控細(xì)胞代謝、表觀遺傳調(diào)控、氧化還原狀態(tài)和DNA修復(fù)的關(guān)鍵酶[21]；IDH1基因突變常見于膠質(zhì)瘤、iCCA、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)等腫瘤細(xì) 胞[18,22]。IDH1 R132C 是iCCA 中 常 見 的 突 變 位點(diǎn)[23]。有研究報道，突變型IDH1對于膠質(zhì)瘤、AML的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，IDH1 突變產(chǎn)物2-HG 可抑制氧戊二酸脫氫酶(oxoglutarate dehydrogenase，OGDH)活性，減少琥珀酰輔酶A(succinyl-coenzyme A，CoA)生成，從而損害血紅素的生物合成，阻礙血細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)髓系腫瘤發(fā)生[24]。Saha 等[9]報道，iCCA中突變的IDH1通過產(chǎn)生D-2羥基戊二酸(D-2-HG)及抑制肝細(xì)胞核因子4α(HNF-4α)活性，可阻斷肝臟前體細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。IDH1 R132S基因缺失可降低iCCA細(xì)胞人肝膽管癌細(xì)胞(RBE)的增殖、遷移、侵襲能力及EMT[20]。目前的研究關(guān)注IDH1 基因突變的致病機(jī)制較多，而IDH1基因缺失對iCCA生物學(xué)行為的影響報道較少。

本研究在iCCA 細(xì)胞HuCCT1 中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除IDH1基因。細(xì)胞功能試驗顯示，IDH1基因缺失可能通過影響細(xì)胞周期的調(diào)控和EMT 的過程，抑制HuCCT1 細(xì)胞的增殖和侵襲遷移。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序結(jié)果顯示，HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞之間DEGs有1476個，顯著富集在MAPK、Rap1、Wnt、Hippo、TNF 等與腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路。隨機(jī)選取KEGG 分析排名前3 位、與iCCA 密切相關(guān)的Wnt 信號通路進(jìn)行驗證，Western Blotting檢測結(jié)果顯示，與HuCCT1WT比較，HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞Wnt 通路的Wnt3a和β-catenin蛋白相對表達(dá)量明顯降低。這一結(jié)果提示，IDH1基因可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控iCCA 細(xì)胞HuCCT1 的遷移、侵襲及EMT過程。

EMT是一個復(fù)雜、可塑、可逆的細(xì)胞過程，是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，使細(xì)胞間的黏附性變?nèi)?，遷移能力增強(qiáng)[25]。研究顯示，EMT過程參與調(diào)控胚胎發(fā)育、組織修復(fù)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、化療耐藥等惡性表型[26]。Wnt 信號通路包括Wnt/β-catenin，Wnt-PCP 和Wnt-Ca2+3 種信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移侵襲、EMT 過程、細(xì)胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用[27]；Wnt3a 為典型Wnt 配體，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[28]。Wei等[29]報道，真核翻譯起始因子3H(EIF3H)可通過Wnt/β-catenin 信號通路穩(wěn)定CCND1 蛋白結(jié)構(gòu)，促進(jìn)iCCA細(xì)胞遷移，并抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，HuCCT1細(xì)胞中IDH1缺失后細(xì)胞的遷移和侵襲能力及EMT受到抑制；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的DEGs 在Wnt 通路上顯著富集；Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與HuCCT1WT比 較，HuCCT1IDH1-/-細(xì) 胞Wnt 通 路 的Wnt3a和β-catenin蛋白相對表達(dá)量明顯降低，以上結(jié)果均提示IDH1基因可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控iCCA細(xì)胞HuCCT1的增殖、遷移、侵襲及EMT過程。

本研究結(jié)果顯示，HuCCT1細(xì)胞IDH1基因敲除后，細(xì)胞增殖受抑制，表現(xiàn)為阻滯于G2/M期。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細(xì)胞的DEGs 在MAPK 通路上顯著富集。MAPK 是一組進(jìn)化高度保守的絲氨酸-蘇氨酸激酶，常見的MAPK包括細(xì) 胞 外 信 號 調(diào) 節(jié) 激 酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 激酶。MAPK 級聯(lián)反應(yīng)參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及生理與病理性應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路[27-29]。已有研究報道，IDH1 基因缺失可通過活性氧激活MAPK包括ERK、JNK和p38信號通路，從而顯著抑制卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、遷移，阻滯細(xì)胞于G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞衰老[30]。HuCCT1細(xì)胞中IDH1基因缺失后是否通過MAPK 通路影響細(xì)胞周期的調(diào)控而抑制細(xì)胞的增殖能力，仍有待進(jìn)一步研究。

iCCA 起病隱匿、易轉(zhuǎn)移，缺乏特異性診斷指標(biāo)，多數(shù)病例確診時已屬晚期，錯過手術(shù)時機(jī)，加之對常規(guī)放化療不敏感，因此該病缺乏有效的治療手段，預(yù)后差[30-32]。目前針對IDH1基因突變的靶向藥物已進(jìn)入臨床Ⅲ期研究，但效果不盡人意，藥物的具體作用機(jī)制也不明確。本研究顯示，IDH1缺失可顯著抑制HuCCT1 細(xì)胞的遷移、侵襲能力和EMT過程，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)。對IDH1基因功能的深入了解，將有助于開發(fā)新的靶向藥物，提高晚期iCCA患者的療效。