甘草酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎性因子及纖維化因子的影響

李媛，王珍，曹雪，侯紹章*

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，寧夏銀川，750004

近年來(lái)，由于飲食方式的改變和人口老齡化趨勢(shì)的加劇，糖尿病及糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DN 患者約占糖尿病患者的40%[3-4]，全世界30%～50%的終末期腎病(ESRD)是由DN 引起的[5-6]，到2030 年，DN 患者將超過(guò)6.43 億[7]。DN 進(jìn)展的關(guān)鍵因素包括系膜細(xì)胞數(shù)量的異常及細(xì)胞因子表達(dá)水平的異常[8]。DN有多種病理特征，較為關(guān)鍵的是系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚及腎小球硬化[9-10]。此外，系膜細(xì)胞還分泌多種炎性因子參與腎小球纖維化過(guò)程[11]，炎癥在DN 的發(fā)展過(guò)程中起重要作用[12-13]，DN 患者血清中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的過(guò)度表達(dá)[14]也支持這個(gè)理論。因此，有效抑制腎小球系膜細(xì)胞炎癥和纖維化是DN的重要治療手段[13]。課題組前期研究結(jié)果表明，甘草酸具有抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞活性的功效[15]，也能夠在一定程度上減輕糖尿病小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷[16]。然而，甘草酸對(duì)高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的影響尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)探討甘草酸對(duì)高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的影響，旨在為DN的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40 MES13)購(gòu)自武漢普諾賽公司；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；6 cm 培養(yǎng)皿購(gòu)自無(wú)錫耐思生物科技有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；青霉素-鏈霉素混合液、甘草酸(GA)購(gòu)自北京索萊寶公司；IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α抗體購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；BSA 購(gòu)自中山金橋公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-共軛二級(jí)抗體購(gòu)自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液、DMEM 高糖培養(yǎng)基(PM150210)、DMEM 低糖培養(yǎng)基(PM150220)、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone 實(shí)驗(yàn)室；D-葡萄糖粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為對(duì)照(NG)組(5.6 mmol/L 葡萄糖)、高糖(HG)組(30 mmol/L 葡萄糖)及HG+GA 組(30 mmol/L 葡萄糖+200 μmol/L GA)，分別干預(yù)培養(yǎng)48 h。小鼠腎小球系膜細(xì)胞分別于細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM 低糖及DMEM高糖培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，并補(bǔ)充10%的胎牛血清及1%的抗生素(100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素)，將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)培養(yǎng)。

1.3 Western blotting 檢測(cè)炎性因子及纖維化因子的表達(dá)水平 將貼壁的小鼠腎小球系膜細(xì)胞干預(yù)48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入適量胰酶消化系膜細(xì)胞，室溫消化2～5 min 后加入培養(yǎng)基終止消化，并于室溫下1500 r/min的低速離心機(jī)中離心5～10 min。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參蛋白，配制SDS-PAGE凝膠，12%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣10 μl蛋白液，80 V條件下行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，恒流200 mA濕轉(zhuǎn)1 h，10%脫脂牛奶封閉2 h，采用兔抗IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及α-SMA 多克隆抗體于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，第2 天37 ℃孵育30 min，1×TBST溶液漂洗10 min×3次，采用山羊抗兔HRP 抗體室溫?fù)u床孵育2 h，1×TBST 溶液漂洗10 min×3 次。最后于黑暗的環(huán)境下滴加ECL化學(xué)發(fā)光HRP底物反應(yīng)液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞炎性因子的表達(dá)變化 在24 孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，干預(yù)48 h 之后，用4%的多聚甲醛溶液固定，PBS 清洗3 次，將細(xì)胞爬片取出，置于載玻片上，滴加山羊血清于37 ℃溫箱封閉2 h，然后采用兔抗IL-1β、TNF-α 及α-SMA 多克隆抗體孵育，于4 ℃冰箱過(guò)夜，第2天在室溫下與異硫氰酸熒光素(FITC)-共軛二級(jí)抗體常溫避光孵育1 h，DAPI 封片，隨后在熒光顯微鏡下觀察熒光圖像。

1.5 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子的表達(dá)變化 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，再分別加入NG 組、HG組、HG+GA組干預(yù)的培養(yǎng)基終止消化。以1500 r/min離心10 min，在6 cm 培養(yǎng)皿中接種1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁，干預(yù)48 h 后，提取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度(OD)值來(lái)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中相關(guān)因子表達(dá)量的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甘草酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG 組 比 較，HG 組 的IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA和TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，而HG+GA 組則無(wú)明顯變化(P＞0.05)；與HG 組比較，HG+GA 組IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)(圖1)。

2.2 免疫熒光檢測(cè)各組腎小球系膜細(xì)胞IL-1β、TNF-α、α-SMA 的表達(dá)水平 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG 組比較，HG 組細(xì)胞IL-1β、TNF-α 及α-SMA 熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P＜0.05)；而與HG 組比較，HG+GA 組的IL-1β、TNF-α 及α-SMA 的熒光強(qiáng)度明顯減弱(P＜0.05)(圖2)。

2.3 甘草酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子分泌的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-6分泌水平明顯升高(P＜0.01 或P＜0.05)，而HG+GA 組無(wú)明顯變化(P＞0.05)；與HG 組比較，HG+GA 組IL-8、IL-1β、TNF-α及IL-6分泌水平降低(P＜0.05)(表1)。

表1 甘草酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子分泌水平的影響（n=3, ±s）Tab.1 Effects of glycyrrhizic acid on high glucose-induced secretion of inflammatory cytokins in mouse glomerular mesangial cells （n=3,±s）

表1 甘草酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞炎性因子分泌水平的影響（n=3, ±s）Tab.1 Effects of glycyrrhizic acid on high glucose-induced secretion of inflammatory cytokins in mouse glomerular mesangial cells （n=3,±s）

IL-1β.白細(xì)胞介素-1β；IL-6.白細(xì)胞介素-6；IL-8.白細(xì)胞介素-8；TNF-α.腫瘤壞死因子-α；NG.對(duì)照；HG.高糖；HG+GA.高糖加甘草酸處理；與NG組相比，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01；與HG組相比，(3)P＜0.05

TNF-α(ng/L)607.44±48.01 891.57±32.09(2)737.50±70.5(3)組別NG組HG組HG+GA組IL-1β(ng/L)39.58±4.53 99.62±4.06(2)62.86±3.21(1)IL-6(pg/ml)25.70±1.75 44.20±7.45(1)27.62±6.82(3)IL-8(pg/ml)32.32±3.86 76.41±6.04(2)46.64±3.54(3)

3 討 論

DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，進(jìn)展過(guò)程中的促炎癥和促纖維化過(guò)程往往源于代謝改變、超濾過(guò)、反應(yīng)性氧化應(yīng)激(ROS)、免疫和炎癥激活及隨后的纖維化[17-23]。DN絕大多數(shù)集中在以糖尿病為主的患者和腎臟功能發(fā)生減退的患者中，這類患者的腎臟因糖尿病的影響而發(fā)生形態(tài)學(xué)或病理結(jié)構(gòu)的變化[24]，最終導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)一系列的臨床癥狀[25]。發(fā)揮主要過(guò)濾功能的腎小球基膜主要由腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)共同構(gòu)成，在病理?xiàng)l件下，系膜細(xì)胞被激活，導(dǎo)致其過(guò)度增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)和多種炎性因子，所有這些都參與了腎小球纖維化的過(guò)程[11]。許多證據(jù)表明，炎癥作為DN 的重要致病機(jī)制[26]，在高糖的刺激下，小鼠SV40 MES13細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及相關(guān)蛋白因子的表達(dá)發(fā)生了一系列變化[27]，IL-1β、IL-6、TNF-α 炎性因子的蛋白表達(dá)水平明顯升高[28]，且在臨床DN 患者血清中也發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6 和TNF-α 存在過(guò)度表達(dá)情況[14,29]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8 及TNF-α 在高糖條件下表達(dá)增高；甘草酸干預(yù)誘導(dǎo)后，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)降低。以上研究均提示促炎細(xì)胞因子分泌過(guò)多很可能與腎損傷加劇有關(guān)[30]。

甘草酸是從豆科植物甘草的根、莖中濃縮提煉所得，甘草的根、莖中含有甘草酸，即三萜皂甙，為甘草中最主要的活性成分[31]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸在一定程度上可減輕DN 的進(jìn)展[15-16,32-33]，但有關(guān)GA 保護(hù)DN 的具體機(jī)制尚未闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，Smad3 的高表達(dá)可促進(jìn)糖尿病小鼠腎纖維化的發(fā)展，這一過(guò)程可通過(guò)敲除Smad3 被抑制[34]；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和P-Smad2、3在高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞中高表達(dá)，甘草酸干預(yù)組可以減少高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1和P-Smad2、3的表達(dá)，提示甘草酸抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[15]可能與TGF-β1-Smads 信號(hào)通路有關(guān)[15]。本課題組前期構(gòu)建了糖尿病小鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)甘草酸可激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路從而預(yù)防DN 的進(jìn)展，且甘草酸可抑制α-SMA 的表達(dá)從而發(fā)揮減緩腎纖維化的作用[16]。本研究也驗(yàn)證了在高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞纖維化因子α-SMA 的表達(dá)升高，甘草酸干預(yù)誘導(dǎo)后α-SMA 的表達(dá)降低。目前，有多種傳統(tǒng)的中草藥用于DN的研究。胡蘆巴堿(TRL)是胡蘆巴種子提取物中的一種活性成分，可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖和纖維化[35]。祛風(fēng)通絡(luò)方可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路降低高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[28]。這些藥物對(duì)DN 炎癥的抑制作用提示長(zhǎng)期的炎癥會(huì)促進(jìn)腎纖維化過(guò)程，可導(dǎo)致發(fā)生終末期腎病[36]，而服用適當(dāng)?shù)乃幬锟蓽p緩這一病變的進(jìn)展，也為研究甘草酸對(duì)于DN 的預(yù)防作用提供了理論思路。

綜上所述，甘草酸作為有效的中草藥，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞纖維化因子的表達(dá)，最終起到保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞的功效，為甘草酸作為DN 的治療藥物提供了理論支撐，可作為進(jìn)一步探究DN 發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，本研究尚存在不足之處，僅在細(xì)胞層面進(jìn)行研究，未在DN 的動(dòng)物模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此，后續(xù)將進(jìn)一步在DN 動(dòng)物模型中驗(yàn)證甘草酸對(duì)腎炎癥及纖維化的影響，以為甘草酸防治DN的臨床應(yīng)用提供參考。