全反式維甲酸抑制核因子E2相關(guān)因子2和血紅素加氧酶1加重大鼠腎臟缺血再灌注損傷表達(dá)

董毅玲，張文文，閆琰，覃志成

作者單位：山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原030012

腎臟缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）是由于腎臟血液供給不足，隨后恢復(fù)血液灌流后腎臟功能無法恢復(fù)正常，造成其功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)受損的一種病理狀態(tài)［1］。在臨床上，缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎損傷（acute renal injury，AKI）的主要原因之一，其病理生理過程包括氧化應(yīng)激、炎癥、腎小管上皮細(xì)胞凋亡、鐵死亡等［2-3］。其中缺血再灌注損傷發(fā)生的主要原因是氧化應(yīng)激。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1信號通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要因子。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種基因轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)控下游抗氧化酶血紅素加氧酶1（heme oxygenase1，HO-1）基因影響細(xì)胞的氧化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原平衡［4］。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）又名視黃酸，是體內(nèi)維生素A的中間代謝產(chǎn)物之一，ATRA可以抑制Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）的結(jié)合能力，其抑制作用是迅速、完全且不可逆轉(zhuǎn)的［5-6］。根據(jù)此特性，本研究于2020年10月至2022年2月通過以大鼠腎臟IRI為模型，觀察ATRA抑制Nrf2、HO-1表達(dá)是否會加重腎臟IRI，同時闡明Nrf2/HO-1通路在腎臟IRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 24只雄性無特定病原體（SPF）級6～8周齡SD大鼠，體質(zhì)量范圍260～350 g，購于山西省人民醫(yī)院動物實驗中心。采用常規(guī)飼養(yǎng)，在禁食12 h后用于本實驗，主要試劑：全反式維甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）購于美國Sigma公司，水合氯醛購于阿拉丁試劑有限公司，兔抗大鼠Nrf2抗體、抗HO-1抗體、山羊抗兔IgG抗體購于北京博奧森生物有限公司，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT -mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）試劑盒、尿素氮（BUN）試劑盒及血肌酐（Scr）試劑盒均購于南京建成生物公司，組化試劑盒DAB顯色劑、PIPA裂解液、PBS緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于武漢塞維爾生物科技有限公司。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（sham組）、腎臟缺血再灌注組（Ischemia/reperfusion，I/R組）及全反式維甲酸組（I/R+ATRA組），每組8只。1周前開始對3組大鼠進(jìn)行腹腔注射，Sham組、I/R組腹腔注射1 mL/kg玉米油，每天1次；將ATRA溶于玉米油中（100 mg/10 mL玉米油），ATRA組腹腔注射溶于玉米油的ATRA（10 mg/kg），每天1次。持續(xù)1周以后，3組大鼠分別腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，待小鼠對刺激無反應(yīng)時，表明麻醉成功，將其處于仰臥位固定在37 ℃恒溫墊上，清潔手術(shù)區(qū)域后沿腹中線逐層切開各層組織，暴露雙側(cè)腎臟，先結(jié)扎右側(cè)腎蒂，然后摘除右腎。Sham組不予以夾閉左腎動脈；I/R組：用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，使左腎缺血，夾閉后看到腎臟顏色變?yōu)榘底仙谌毖陂g隨時將傷口用紗布覆蓋，并補(bǔ)充0.9%氯化鈉溶液，缺血45 min后取出血管夾，恢復(fù)腎臟血供，當(dāng)腎臟顏色回至正常顏色時，表明腎臟再灌注成功。I/R+ATRA組：與I/R組實驗過程相同，建立腎臟I/R模型。逐層縫合手術(shù)切口，整個實驗操作過程注意無菌操作，待大鼠清醒后，放入籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。3組大鼠于實驗結(jié)束24 h后留取各組血液及腎組織標(biāo)本。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測腎組織蛋白水平 將切開的腎組織、勻漿珠、RIPA裂解液進(jìn)行充分研磨，離心后提取上清液及總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，通過沸水浴將蛋白溶液變性后，分別進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗（Nrf2為1∶1 000，HO-1為1∶1 000）孵育過夜后，加入二抗（按1∶5 000進(jìn)行稀釋）在室溫下孵育半小時后，用TBST緩沖液沖洗3次。最后用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。用Alpha軟件分析、定量蛋白質(zhì)水平，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 腎組織SOD、MDA檢測 取腎組織約50 mg，將其制作成10%勻漿液，根據(jù)試劑盒說明書，通過比色法檢測腎組織的SOD活性及MDA含量。

1.2.4 腎組織活性氧檢測 DHE染色評估腎組織活性氧：將冷凍的腎組織冰凍切片，進(jìn)行DHE染色，在熒光顯微鏡（日本尼康）下觀察紅色熒光。分別測量每張切片中6個視野陽性的累積光密度值（IOD）以及對應(yīng)的組織像素面積（Area），并計算出活性氧相對表達(dá)量即面密度（Areal density）=IOD/Area進(jìn)行分析，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 血清Scr、BUN檢測 將裝有實驗大鼠血清的EP管進(jìn)行離心，取上層血清成分，通過全自動生化分析儀，根據(jù)試劑盒說明書，檢測肌酐和尿素氮的含量。

1.2.6 組織病理學(xué)檢查 用石蠟包埋腎臟組織，將大鼠腎組織切片切成3 μm厚，蘇木精-伊紅（HE）染色處理后，顯微鏡下觀察腎臟病理形態(tài)變化。腎小管損傷程度評分：0分，代表正常；1分，代表微創(chuàng)傷（外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞＜5%）；2分，代表輕度破壞（外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞5%～25%）；3分，代表中度破壞（外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞＞25%～75%）；4分，代表嚴(yán)重破壞（外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞＞75%）［7］。每張切片至少選8個皮髓交界部視野觀察（×200）。

1.2.7 腎臟組織凋亡細(xì)胞檢測 根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。每張切片取6個細(xì)胞分布不重疊的視野，采集圖像。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計并繪圖，計量資料以表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量比較 與Sham組相比，I/R組大鼠的腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+ATRA組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1，表1。

表1 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量/

表1 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量/

注：Nrf2為核因子E2相關(guān)因子2，HO-1為血紅素加氧酶1。①與Sham組比較，P＜0.01。②與I/R組比較，P＜0.01。

組別Sham組I/R組I/R+ATRA組F值P值HO-1相對表達(dá)量0.024±0.007 0.37±0.79①0.15±0.03②106.79＜0.001鼠數(shù)8 8 8 Nrf2相對表達(dá)量0.06±0.01 0.52±0.09①0.29±0.04②120.62＜0.001

圖1 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量

2.2 腎組織SOD、MDA表達(dá) 與Sham組比較，I/R組腎組織SOD活性減弱，MDA含量增高（P＜0.05）；與I/R組比較，ATRA處理后的腎組織SOD活性明顯下降，MDA含量明顯增高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量比較/

表2 各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量比較/

注：SOD為超氧化歧化酶，MDA為丙二醛。①與Sham組比較，P＜0.05；②與I/R組比較，P＜0.05。

組別Sham組I/R組I/R+ATRA組F值P值MDA/（nmol/mg）15.71±1.73 23.14±2.51①30.47±3.74②56.17＜0.001鼠數(shù)8 8 8 SOD/（U/mg）366.92±36.01 281.99±9.96①190.37±11.23②122.92＜0.001

2.3 腎組織活性氧表達(dá) 用活性氧熒光探針DHE染色，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相比于Sham組，I/R組腎組織細(xì)胞內(nèi)有微弱的紅色熒光，活性氧相對表達(dá)量增加（t=7.76，P＜0.001，其中Sham組和I/R組的活性氧相對表達(dá)量分別為（0.20±0.04）%和（0.97±0.27）%；與I/R組比較，I/R+ATRA組紅色熒光明顯增強(qiáng)，活性氧相對表達(dá)量（2.14±0.46）%明顯增加（F=79.34，P＜0.001）。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織活性氧表達(dá)（DHE染色×200）

2.4 各組大鼠Scr及BUN表達(dá) 與Sham組相比，I/R組血清Scr、BUN水平均升高（P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+ATRA組血清Scr、BUN含量均明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清 Scr、BUN 水平比較/

表3 各組大鼠血清 Scr、BUN 水平比較/

注：Scr為肌酐，BUN為尿素氮。①與Sham組比較，P＜0.01。②與I/R組比較，P＜0.01。

組別Sham組I/R組I/R+ATRA組F值P值BUN/（mmol/L）6.36±1.33 16.46±1.37①23.31±1.23②338.21＜0.001鼠數(shù)8 8 8 Scr/（μmol/L）74.38±7.57 121.97±13.94①341.48±23.73②597.89＜0.001

2.5 各組大鼠腎臟病理情況比較 Sham組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)及組織學(xué)正常，腎小管損傷病理評分為（0.75±0.46）分；與Sham組比較，I/R組可見部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，腎小管損傷評分（3.13±0.64）分較高（t=8.50，P＜0.001）；與I/R組相比，I/R+ATRA組病理改變明顯加重，腎小管管腔明顯水腫、擴(kuò)大，刷狀緣消失，伴大量空泡變性，腎小管間質(zhì)出現(xiàn)纖維化病變，伴大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管損傷評分（4.88±0.35）分明顯增高（F=137.17，P＜0.001）。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟病理情況比較（HE染色×200）

2.6 各組大鼠腎組織的細(xì)胞凋亡情況 Sham組有微量凋亡細(xì)胞表達(dá)，凋亡細(xì)胞陽性率為（0.48±0.09）%；與Sham組相比，I/R組大鼠腎組織凋亡細(xì)胞表達(dá)增加（P＜0.05），凋亡細(xì)胞陽性率為（1.06±0.26）%；與I/R組比較，I/R+ATRA組凋亡細(xì)胞表達(dá)明顯增加（P＜0.05），其凋亡細(xì)胞陽性率為（1.74±0.08）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=117.64，P＜0.001），見圖4。

圖4 各組大鼠腎臟組織凋亡細(xì)胞比較（TUNEL染色×200）

3 討論

急性腎損傷常見的原因是腎臟IRI，腎臟IRI是一種復(fù)雜的病理生理事件，而氧化應(yīng)激是腎臟IRI發(fā)生發(fā)展的主要病理生理機(jī)制［8］。在腎臟缺血再灌注階段，組織重新獲得氧從而產(chǎn)生大量的活性氧，直接造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致氧化-抗氧化能力失衡，加重細(xì)胞損傷、壞死［9］。有相關(guān)證據(jù)表明，減少與腎臟IRI相關(guān)的氧化應(yīng)激有助于改善腎臟功能，提高生存率，緩解腎IRI［10］。

Nrf2作為機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，Nrf2主要與其抑制劑Keap1（Kelch-like ech-associated protein 1，Keap1）結(jié)合保留在細(xì)胞質(zhì)中，維持低轉(zhuǎn)錄活性［11］。在細(xì)胞受到親電試劑或其他活性物質(zhì)（如活性氧）刺激時，Nrf2與Keap1解耦聯(lián)，活化的Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并與Maf蛋白結(jié)合形成異質(zhì)二聚體后與ARE結(jié)合，導(dǎo)致一系列基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)控Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶（HO-1、過氧化物酶-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶等）或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄活性［12-13］。HO-1能促進(jìn)產(chǎn)生膽綠素、鐵離子和一氧化碳，這些產(chǎn)物在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞炎癥以及促進(jìn)血管生成等方面發(fā)揮重要作用［14］。有研究表明，許多疾病的發(fā)生、發(fā)展與Nrf2/HO-1通路抑制導(dǎo)致的氧化應(yīng)激增強(qiáng)有關(guān)。例如在橫紋肌溶解的急性腎損傷中，Nrf2基因敲除的小鼠活性氧顯著增加，其腎功能和生存率明顯降低［15］。因此Nrf2/HO-1是生物進(jìn)化過程中對外界刺激形成防御的一種抗損傷機(jī)制，也是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的主要信號通路［16-17］。

在缺血再灌注狀態(tài)下，體內(nèi)的氧化物質(zhì)大量堆積，而抗氧化物質(zhì)大量丟失，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，蛋白質(zhì)功能抑制，核酸及染色體破壞，進(jìn)一步加重病情惡化［18］。許多研究表明活性氧作為體內(nèi)強(qiáng)氧化物，可以氧化核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及染色體等物質(zhì)；同時導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，阻斷ATP合成，進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)缺血再灌注的發(fā)生、發(fā)展［19］。而SOD作為細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除劑可清除活性氧，在減輕IRI中發(fā)揮重要作用［20］。自由基可通過作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，生成丙二醛（MDA），可直接引起細(xì)胞毒性損傷，因此，組織MDA含量被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的一個重要指標(biāo)［21］。本實驗結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組腎組織活性氧表達(dá)升高，SOD的活性受到抑制，MDA含量上升，伴血清Scr、BUN升高，腎臟病理、腎臟組織細(xì)胞凋亡增加，說明大鼠腎臟缺血再灌注損傷會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。同時與Sham組相比，I/R組大鼠腎組織的Nrf2、HO-1表達(dá)增加，進(jìn)一步說明Nrf2/HO-1通路可能參與腎臟缺血再灌注損傷過程。

此外本研究結(jié)果顯示，與I/R組相比，大鼠造模前行Nrf2阻斷劑ATRA預(yù)處理后，腎組織Nrf2、HO-1的表達(dá)顯著減少，SOD活性嚴(yán)重下降，活性氧、MDA含量明顯增加，伴腎功能、腎病理損傷加重，腎臟組織細(xì)胞凋亡亦明顯增加。研究結(jié)果提示，ATRA通過抑制腎IRI中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，降低組織抗氧化損傷的作用，加重腎組織細(xì)胞的病理損傷及凋亡，進(jìn)一步加重腎臟IRI，說明ATRA抑制Nrf2、HO-1表達(dá)會加重腎臟缺血再灌注損傷進(jìn)程。

綜上所述，Nrf2/HO-1通路參與腎臟缺血再灌注損傷過程，行ATRA預(yù)處理后會抑制大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達(dá)，加重氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重腎臟IRI。研究結(jié)果提示，在腎臟缺血再灌注過程中激活Nrf2/HO-1信號通路，可以增強(qiáng)組織細(xì)胞的抗氧化能力，減輕腎臟IRI損傷，這為我們治療或減輕腎臟IRI進(jìn)程提供了理論依據(jù)。