HIF-1α對慢性腎臟病血管鈣化作用的相關研究進展*

李姍姍，孫 倩，楊少寧，屈 凱，于小勇△

1 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2 陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是各種原因導致的慢性腎臟結構和功能異常，或者腎小球濾過率低于60 mL/（min·1.73m2），腎臟損害病史大于3個月。我國CKD患者總體發病率呈逐年增加趨勢，已造成巨大的社會和經濟負擔［1-2］。其中，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）死亡人數約占CKD患者總死亡人數的1/2，已成為CKD 患者首要致死原因［3］。血管鈣化（vascular calcification，VC）是由羥基磷灰石晶體（又稱為羥磷灰石、堿式磷酸鈣）異位沉積于血管壁而產生，類似于骨形成的主動調節過程，是CVD 發生的獨立預測因子，已成為增加CKD患者心血管死亡率和全因死亡率的主要危險因素［4］。近年來，相關研究表明，缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α）是誘發或加重血管鈣化的重要轉錄因子，在CKD血管鈣化大鼠血清中過表達，且與主動脈鈣化損傷呈正相關［5］。HIF-1α不僅可通過調節血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）、骨相關因子runt 相關轉錄因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein，BMP-2）等多種成骨細胞分化的關鍵轉錄因子及骨相關蛋白標志物的表達，促進VSMCs 成骨樣分化，最終導致VC 形成［6］，還通過誘導炎癥反應及氧化應激、誘導細胞凋亡及細胞自噬、參與糖酵解途徑等誘導VC形成。現從HIF-1α對CKD血管鈣化的影響進行綜述。

1 HIF-1α的概念及機制

HIF 是由對氧敏感的活性功能性亞基α 和僅在細胞內穩定表達β亞基組成的異源二聚體，是細胞適應缺氧、維持氧穩態的關鍵轉錄調節因子，在低氧條件下穩定表達。HIF-α有3個亞基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。其中，HIF-1α幾乎在所有細胞中都有表達，而在腎組織中特異性表達于腎小管細胞（主要是集合管）。正常情況下，HIF-1α上的特異性脯氨酸殘基被脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）羥基化，被E3 泛素連接酶（von hippel-lindau protein，VHL）識別并泛素化，然后通過蛋白酶快速降解［7］，這一過程使其表達和降解處于動態平衡。在低氧狀態下，PHD活性被抑制，HIF-1α的降解被阻斷，表達增加，HIF-1α由細胞質轉移到細胞核內，與細胞核內HIF-1β結合形成轉錄起始復合物，啟動下游相關靶基因轉錄，介導多種靶細胞適應性低氧反應［8］。HIF-1 參與調控的靶基因超過100 種，主要包括［9-10］：1）血管內皮生長因子相關基因；2）血紅素加氧酶相關基因；3）促紅細胞生成素相關基因；4）葡萄糖轉運體1 和糖酵解酶類基因。這些靶基因在促進血管再生、調節鐵代謝、促進紅細胞生成、調節能量及細胞外基質代謝、誘導骨形成、炎性反應、細胞增殖等方面起重要作用。

2 CKD血管鈣化的概念及機制

2.1 CKD 血管鈣化的西醫學認識近年研究發現，血管鈣化是一個類似成骨分化的可調控主動生物學過程，是由羥基磷灰石異位沉積于血管壁上產生［11］，是多種常見病的共同病理表現，如高血壓、糖尿病、CKD 及動脈粥樣硬化等［12］。主要包括血管內膜鈣化、血管中膜鈣化、心臟瓣膜鈣化和鈣化防御。其中血管中膜鈣化常發生于CKD 血管鈣化過程。

2.2 CKD 血管鈣化機制CKD 患者腎臟長期處于缺血、缺氧狀態，可誘導多種機制促進VC 的發生發展。同時，VC的發生又可進一步加重腎臟缺血、缺氧，因此，VC 的發展與腎功能進展呈正相關。CKD 血管鈣化發病機制錯綜復雜，尚未明確，目前研究發現可能與以下因素有關：1）各種刺激因子如尿毒癥毒素、高磷血癥、細胞因子、炎癥反應、氧化應激等誘導VSMCs 成骨樣轉分化［13］；2）鈣化促進因子/鈣化抑制因子失衡［14］，鈣化促進因子如BMP-2、骨鈣素（bone gla protein，BGP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等蛋白表達上調，促進血管鈣化形成；鈣化抑制因子如胎球蛋白A（Fetuin A）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、基質Gla蛋白（matrix protein Gla，MPG）等表達下調，抑制促鈣化因子表達，抑制血管鈣化［15］；3）氧化應激和炎癥反應：CKD 后期由于尿素氮等毒素蓄積，活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產生增加，ROS 作為促進血管鈣化的獨立危險因素，可通過氧化應激參與血管鈣化的形成；CKD 后期尿毒癥內環境有利于炎癥細胞生長和炎癥因子釋放，這些炎癥因子通過不同途徑參與VSMCs 成骨樣轉分化，最終誘導血管鈣化；4）細胞凋亡和細胞自噬：VSMCs 發生凋亡后產生的降解產物-基質囊泡是血管鈣化的始動環節；自噬通過調控VSMCs 表型轉換，減少VSMCs 基質囊泡釋放［16］。近年來，關于信號通路對血管鈣化影響的研究 較 多，如Klotho/FGF-23 軸［17］、Notch 信 號通路［18］、Wnt/β-catenin 信號通路［19］及HIF-1α［20］也參與血管鈣化的發生發展。

綜上所述，多種危險因素造成血管鈣化形成的大環境，這種內環境的改變會誘導多種機制參與血管鈣化的發生發展，同時會受到多種信號通路和細胞因子調控，這些因素相互作用，最終誘導VSMCs發生成骨樣轉分化，促進CKD血管鈣化的形成。

2.3 CKD 的中醫學認識CKD 屬中醫“關格”“腎癆”“水腫”等范疇，進展至后期，以脾腎虧虛為本，瘀毒濕濁蓄積為標。血管鈣化是CKD尤其是ESRD最常見的并發癥之一，是在“關格”基礎上發生的虛實夾雜疾病，其基本病機仍以脾腎兩虛為本，因虛致瘀血內阻，瘀血濁毒互結于血脈而致血脈痹阻，發為“胸痹”“脈痹”［3］，而本虛與標實之間又相互影響，相互促進。于思明等［21］認為VC 的發生與心不主血脈，或久病致瘀，瘀濁壅滯脈道，血行受阻有關。張璐蕓等［22］基于“痰瘀毒”論治觀點，運用健脾補腎通絡方，以補氣為主，通絡為輔，在調節鈣磷代謝平衡，降低血管鈣化的發生方面療效頗佳。近代學者認為CKD 血管鈣化是在脾腎虧虛的基礎上發生瘀血濁毒互結，痹阻于脈道，而瘀血濁毒反之又損傷人體正氣，兩者相互促進，相互影響，導致血管鈣化的發生發展［23］。

綜上所述，血管鈣化屬中醫“脈”的范疇，歸心所主，與心不主血脈有關，是由腎臟衰敗累及五臟所致，其基本病機以脾腎兩虛為本，濁毒、瘀血互結為標，而血瘀是血管鈣化的基本病機，故治當補益脾腎，兼祛痰濁、清瘀血。

3 HIF-1α參與CKD血管鈣化形成

3.1 HlF-1α 通過促進VSMCs 成骨樣分化參與血管鈣化在低氧、炎癥等刺激下，VSMCs 失去收縮型標志物，從去分化狀態的收縮表型轉變為合成表型，發生成骨樣分化，誘導血管鈣化，增加CKD患者心血管疾病的發生率和全因死亡率［24］。其中VSMCs 收縮蛋白如α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平 滑 肌22α（smooth muscle protein 22α，SM22α）表達減少，成骨表型標志物如Runx2、ALP、BMP-2 表達上調，提示VSMCs表型轉化與血管鈣化關系密切，在CKD血管鈣化形成中發揮重要作用［25］。研究發現，HIF-1α作為關鍵低氧誘導因子，也是VSMCs 促進鈣化的關鍵因子，低氧可強化無機磷酸鹽介導的VSMCs成骨轉分化和鈣化［26］。研究發現，在5/6 腎切除聯合高磷高鈣飲食誘導的大鼠CKD 血管鈣化模型中，血管鈣化的VSMCs 相關標志物表達下調，相反，HIF-1α及其下游靶基因如VEGF-A mRNA、葡萄糖轉運體1（glucose transporter type 1，GLUT1）mRNA 表達增加［26］。同時，VEGF-A 還可激活下游Notch1 信號通路，增加VSMCs 成骨表型標志物如BMP-2、RUNX2 等的表達，誘導VSMCs 成骨樣轉分化。VSMCs 在無機磷酸鹽介導下，細胞中鈣含量、HIF-1α及其靶基因、成骨表型標志物的表達均上調，而在缺氧狀態下該表達更顯著。但當HIF-1α表達被抑制后，VSMCs 中鈣含量、成骨表型標志物表達較對照組無明顯差異，說明HIF-1α信號通路能參與并加重無機磷酸鹽介導的VSMCs 成骨樣分化和鈣化。

3.2 HlF-1α 通過糖代謝途徑參與血管鈣化丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是維持丙酮酸氧化和體內葡萄糖平衡的關鍵酶，在調節丙酮酸脫氫酶復合物活性中發揮重要作用。在低氧狀態下，HIF-1α可誘導PDK4 表達［27］，而PDK4 則可通過氧化應激、細胞凋亡等機制誘導血管鈣化的發生發展［28］。研究表明，晚期糖基化終末產物（advanced glyco-sylation end-products，AGEs）以劑量依賴方式提高HIF-1α和PDK4 表達，上調HIF-1α調控基因VEGFA和GLUT-1 表達，而HIF-1α的穩定表達增加了PDK4 表達水平［27］。此外，AGEs 誘導的VSMCs 鈣化過程降低了葡萄糖消耗，減少了乳酸產生，下調了葡萄糖代謝的關鍵酶和氧消耗率，說明AGEs 可通過HIF-1α/PDK4 途徑促進血管鈣化并抑制葡萄糖代謝。骨鈣素（bone gla protein，BGP）是一種由成骨細胞產生的能量代謝調節激素，是葡萄糖代謝和礦化的重要調節因子，在鈣化血管中普遍存在［29］。HIF-1α作為軟骨細胞在體內生存的必要因素與BGP關系密切。IDELEVICH等［30］研究發現，在1，25（OH）2D3誘導的血管鈣化大鼠模型中，BGP、HIF-1α、磷酸果糖激酶（phosphor fructo kinase，PFK）mRNA 在鈣化的主動脈上表達上調，且在BGP誘導的鈣化中，VSMCs上HIF-1α、PFK、GLUT1、Runx2及ALP 表達增加，而利用SiRNA 抑制HIF-1α穩定表達后可緩解BGP 誘導的VSMCs 鈣化。表明BGP可通過增加HIF-1α依賴的糖代謝途徑，即促進葡萄糖攝取，增加GLUT 和糖酵解酶表達，激活胰島素信號通路，上調葡萄糖轉運，將葡萄糖導入糖酵解途徑，并刺激軟骨和血管鈣化。此外，研究發現［31］，缺氧狀態上調了HIF-1α及其靶基因GLUT1和VEGFA 表達，誘導軟骨標記物RUNX2、SOX9、ALP 上調，導致VSMCs 鈣化。說明低氧通過HIF-1α依賴和線粒體來源的活性氧依賴方式誘導血管鈣化。然而，HIF-1α參與糖代謝途徑介導血管鈣化及腎臟代謝尚需要進一步研究其機制，以明確HIF-1α在糖酵解過程中的角色。

3.3 HlF-1α 通過誘導炎癥及氧化應激參與血管鈣化慢性炎癥是血管鈣化的一個重要誘導因素，炎癥及炎癥因子可直接或間接參與血管鈣化的發生發展［32］，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）等炎癥細胞激活及炎癥因子釋放可誘導氧化級聯反應，通過誘導VSMCs 成骨樣轉分化導致血管鈣化。AGHARAZII 等［33］研究發現，CKD 模型大鼠在發生血管鈣化過程中，VSMCs 成骨樣轉分化伴隨BMP-2 和BGP 表達上調，同時，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達也上調。研究發現，冠狀動脈鈣化與血清IL-18 水平呈正相關。IL-18 通過激活TRPM7 通路，促進β-甘油磷酸誘導的VSMCs 成骨樣轉分化，最終導致血管鈣化［34］。表明IL-18可能在促炎性疾病中誘導血管鈣化發生。ROS 能夠上調成骨表型轉錄因子表達，促進VSMCs 成骨樣轉分化，是誘導血管鈣化的獨立危險因素，可通過氧化應激誘導血管鈣化。研究表明［35］，患有糖尿病的CKD 患者氧化應激和成骨細胞分化相關標志物增加，會發生更嚴重的血管鈣化，而抗氧化療法可預防VC進展。研究發現，HIF-1α可作用于內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞，上調誘導型NOS（inducible NOS，iNOS）、VEGF、ROS和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），激活核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，進而使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等細胞因子表達增加，誘導炎癥反應，最終促進VSMCs 成骨樣轉分化，導致血管鈣化，而這些炎癥相關因子又可上調HIF-1α表達，表明炎癥與氧化應激協同作用共同參與血管鈣化過程，而HIF-1α通過調控炎癥反應、氧化應激途徑參與血管鈣化形成，使炎癥、氧化應激、HIF-1α形成相互促進的復雜網絡，最終形成“炎癥-鈣化”的惡性循環［36-37］。

3.4 HlF-1α 通過誘導細胞凋亡和細胞自噬參與血管鈣化血管平滑肌細胞凋亡是血管鈣化啟動的關鍵過程之一，發生于血管鈣化開始前，產生的凋亡小體被認為是血管鈣化的始動因素，在CKD高磷環境的刺激下可誘導局部鈣磷酸鹽富集，為鈣晶體的形成提供合適的微環境，從而啟動血管鈣化［38］。因此，控制細胞凋亡可直接影響血管鈣化的發生發展。細胞自噬是一種細胞降解的生物學過程，是誘導細胞主動死亡的一種細胞死亡程序，增加血管內自噬水平能夠減少細胞外基質囊泡的分泌，拮抗VSMCs 鈣化［39］。研究表明［40］，AGEs通過HIF-1α/PDK4 信號通路增加VSMCs 自噬，增加的自噬在AGEs 誘導的血管鈣化中發揮保護血管作用。因此，細胞凋亡、細胞自噬與血管鈣化的發生發展密切相關。研究發現，HIF-1α 誘導細胞自噬［41-42］，并通過介導線粒體途徑及死亡受體（death receptor，DR）途徑介導缺氧誘導的GC-2細胞凋亡［43］。此外，EPO 可抑制內質網應激誘導的細胞凋亡，而HIF-1α可直接調控EPO，誘導腎臟內源型基因表達，進而抑制血管鈣化［44］。雖然細胞自噬與細胞凋亡已被證實在血管鈣化中發揮重要作用，但是相關信號通路及體內外實驗研究較少，希望更深入的研究闡釋細胞自噬和細胞凋亡在血管鈣化中的作用機制。而HIF-1α通過細胞凋亡和細胞自噬途徑在血管鈣化中發揮重要作用也需要更深入的研究闡明其機制。

綜上所述，HIF-1α通過促進VSMCs 成骨樣分化、糖代謝途徑、誘導炎癥及氧化應激、誘導細胞凋亡和細胞自噬等途徑參與血管鈣化，通過促進多種細胞因子釋放和信號通路激活，使促鈣化因子和抑制鈣化因子失去平衡，最終導致VSMCs 成骨樣轉分化，促進血管鈣化的發生。

4 CKD血管鈣化的防治

CKD 患者血管鈣化是一個不可逆的快速進展過程。2017 年改善全球腎臟病預后組織（kidney disease：improving global outcomes，KDIGO）關于CKD 礦物質與骨異常新版指南指出：維持性血液透析G3a-G5D 期患者一旦合并血管或瓣膜鈣化，應將其心血管風險升至最高級別［45］。由于血管鈣化一旦發生難以治療，CKD 血管鈣化的重點在于早期防治，不僅要控制好高血壓、高血糖、高血脂、營養不良等傳統影響因素，也要控制高磷血癥、避免高鈣血癥及控制甲狀旁腺功能等非傳統影響因素；維生素K、鎂及焦磷酸鹽等也成為防治CKD 血管鈣化新型治療靶點［46］。此外，有研究發現［47］，雌激素能通過調節HIF-1α 影響BMP-2 及其下游p-Smad1/5/8 蛋白水平，抑制VSMCs 鈣化，在血管鈣化中發揮重要作用，可能成為新的治療靶點。

近年研究表明，通過中藥保留灌腸等多種途徑抑制相關細胞因子和相關通路表達，在防治血管鈣化中發揮作用［48］。劉海林［49］通過體內實驗發現葛根素可能通過抑制NLRP3/Caspasc1/IL-1β、NF-κB和ROS相關通路介導的炎癥反應，進而有效抑制CKD 大鼠血管鈣化。鐘建等［50］基于“脾腎衰敗、濁毒內蘊”的基本病機，對溫陽通絡泄濁方進行臨床研究，結果顯示，此方可能通過調控Klotho/FGF-23 軸，改善血脂代謝，降低炎癥因子表達，緩解鈣磷代謝紊亂，從而緩解維持性血液透析患者血管鈣化。王嵐等［51］認為腎精虧虛、脈絡瘀阻是導致CKD-MBD 與血管鈣化的主要病機，運用益氣補腎、祛瘀化濁法可通過調節Klotho 及其下游FGF-23表達，改善CKD鈣磷及骨代謝紊亂，緩解血管鈣化。宋立群［52］在培補脾腎，調和陰陽，祛瘀泄濁，通利血脈的基礎上自擬祛瘀化濁方，在調節礦物質代謝紊亂和PTH 異常升高方面發揮作用，能夠緩解CKD 患者血管鈣化，減少患者心血管并發癥。補腎活血方［53］通過調節骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和NF-κB 受 體 激 動 劑 配 體（receptor activator of the nuclear factorkappa b ligand，RANKL）的mRNA 表達，上調a-SMA蛋白表達，下調ALP，還能減少VSMCs 的堿性磷酸酶活性和鈣沉積，從而抑制VSMCs 成骨表型轉變。何錫坤等［54］觀察化瘀益腎方灌腸聯合腹膜透析療法對CKD3-4 期患者血管鈣化的作用，結果顯示，聯合療法能夠有效減輕血清ICAM-1、VCAM-1、NF-κB、TNF-α等炎性指標表達，減輕炎性反應，延緩血管鈣化。目前CKD 血管鈣化多以對癥治療為主，而中醫藥對血管鈣化防治的臨床與實驗研究已逐漸顯示出其獨特優勢。中藥單體、中藥復方及中藥單體提取物可通過調控細胞因子和信號通路穩定鈣磷代謝水平、控制炎癥反應以及氧化應激，進而延緩血管鈣化進程；此外，中藥通過多途徑給藥如口服湯劑、中藥灌腸、結腸透析、靜脈滴注等干預措施在控制血管鈣化進展中發揮了優勢［55］。因此尋找中西醫結合防治CKD患者血管鈣化的有效手段有重要意義，而內外治法聯合應用將成為中醫藥防治CKD 血管鈣化的重點，同時深入的基礎研究成果也將為臨床應用提供基礎。

5 總結與展望

HIF-1α作為調節機體氧穩態的關鍵核轉錄因子，生物學功能復雜，不僅受多種細胞因子調節，還能直接調控靶基因的轉錄激活，并且與多種信號通路相互作用，通過多種途徑直接或間接參與CKD血管鈣化的發生發展，可能成為CKD血管鈣化的獨立危險因素、潛在生物標志物以及新型防治靶點。然而，雖然眾多證據表明HIF-1α通過多種途徑參與血管鈣化的形成與進展過程，但是其具體機制仍需要進一步探究。VSMCs 成骨樣轉分化過程中，有多種細胞因子和信號通路參與，HIF-1α與各種細胞因子的復雜機制尚不明確，與其他信號通路的相互關系尚不清楚。在CKD 早期，HIF-1α激活能改善腎功能和腎臟代謝，說明HIF-1α適當表達對于CKD 患者腎功能和腎臟代謝有一定改善作用。因此，HIF-1α 參與糖代謝途徑誘導血管鈣化以及腎臟代謝需要進一步的研究以闡釋其機制，以明確HIF-1α 在糖酵解過程中的作用；HIF-1α通過誘導細胞凋亡及細胞自噬介導血管鈣化過程中的具體機制尚不明確，需要更深入的研究；此外，細胞凋亡和細胞自噬之間的相互關系以及在血管鈣化中的作用有待進一步研究。近年來研究發現，基因重塑以及miRNA 調控在血管鈣化中發揮重要作用，但是HIF-1α在其中的作用鮮有研究。對于血管鈣化的防治，中醫藥憑借多途徑、多靶點、多通路在預防CKD 血管鈣化過程中發揮作用，但是目前中醫藥對于CKD 血管鈣化的研究方式和研究對象較單一，需要多中心、大樣本、隨機對照實驗來深層次闡明其復雜機制。近年來，中藥復方、中藥單體通過抑制HIF-1α表達抑制炎癥反應、氧化應激、細胞自噬等發揮重要作用，但是中醫藥通過調控HIF-1α途徑防治血管鈣化的研究較少。因此，科學規范地多角度探討HIF-1α在CKD血管鈣化中的作用機制，將為CKD血管鈣化的防治提供新思路、新靶點。