結核病實驗室診斷方法的現狀與進展

王澤錦，胡素俠，戚應杰

（1.安徽理工大學醫學院，安徽 淮南 232063；2.安徽理工大學第一附屬醫院檢驗科，安徽 淮南 232007；3.中國科學技術大學附屬第一醫院感染病院檢驗科，安徽 合肥 230036）

結核病(tuberculosis，TB)是一種傳染性疾病，由結核分枝桿菌（MTB）引起，多通過空氣進行傳播，常見癥狀為咳嗽、發熱、盜汗、體重減輕等。結核病感染人數約占全球的1/4，每天約4 000人死于該病，近30 000人感染可預防、治愈的結核病[1]。據世界衛生組織（WHO）統計2021年約有1 060萬人患結核病，患病人數與2020年相比增加4.5%，其中160萬人死于結核病[包括18.7萬人類免疫性缺陷病毒（簡稱HIV）陽性者][2]。結核病實驗室診斷是發現傳染源的主要方法，但傳統檢測方法周期長、靈敏度低，無法滿足臨床需求。因此聯合運用新的輔助診斷方法，對全球結核病研究和防控具有重要意義。本研究將從細菌學、免疫學、分子生物學的相關檢測及結核病組學研究等方面總結結核病實驗室診斷的現狀與進展，并作如下綜述。

1 結核病細菌學檢測

目前，結核病的細菌學檢測仍是診斷感染結核病的金標準。痰涂片和培養是應用最廣泛的結核病實驗室診斷技術, 常見方法為抗酸涂片染色法、熒光染色法、傳統結核菌固體培養和全自動結核分枝桿菌培養儀快速檢測。

1.1 涂片染色與熒光染色技術萋尼氏抗酸染色痰涂片顯微鏡檢查是最經典的結核分枝桿菌檢測方法，具有經濟、迅速、操作簡單的優點，但靈敏度較低。有研究對抗酸染色陽性病例進行分析，在收集的結核抗酸染色14 060例樣本中，陽性307例，陽性率為2.18%[3]。可見此方法出現假陰性的情況較多，受主觀因素和標本質量影響較大。熒光染色則運用熒光提高顯微鏡檢查的靈敏度，但由于價格昂貴目前難以普及。

1.2 培養技術傳統固態培養法靈敏度略高于涂片法，是鑒定活菌的可靠方法，還可進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗；但其培養時間長，需4～6周才能檢測到菌種，且無法區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌。培養儀的原理是基于液體培養法，以全自動分枝桿菌培養監測儀為（BD公司，型號：BACTEC MGIT960）代表，其通過測定液體培養基中氧氣消耗量來判定 MTB有無生長。王巍等[4]比較了羅氏培養法與BACTEC MGIT960檢測系統在肺結核中的應用，結果顯示BACTEC MGIT960培養陽性率為67.6%，羅氏培養陽性率為53.3%，且前者檢測周期明顯縮短。但也存在該技術對實驗室生物安全級別要求高、成本高等缺點，不能大規模普及。因此，應聯合其他輔助診斷方法提高陽性檢出率，在此基礎上尋找細菌學證據。

2 結核病免疫學檢測

免疫學檢測方法包括TB抗原和抗體檢測、多種抗體聯合檢測、結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）、γ-干擾素釋放試驗（interferon-γ release assays，IGRAs）、重組結核桿菌融合蛋白（ESAT6-CFP10，EC）皮膚試驗等。

2.1 結核病抗原和抗體檢測技術TB 抗原包括菌體細胞、結核菌素（PPD）、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)、熱休克蛋白65（HSP）抗原、早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6) 等。由于抗原成分復雜且存在交叉抗原，所以，目前通過技術對抗原進行表達和純化，大量制備TB蛋白質成分以檢測人體內是否存在抗體。膠體金免疫層析法檢測結核病患者中特異性結核抗體免疫球蛋白（Ig）G／IgM 的靈敏度為41.15%、特異度為91.67%[5]，可見多種抗原和抗體聯合檢測有助于提高檢測的敏感性，但仍受患者年齡、檢測的抗體類型(IgG、IgM、 IgA) 、結核病感染類型等多方面因素的影響。

2.2 結核菌素皮膚試驗技術TST是實驗室診斷方法之一，是基于Ⅳ型變態反應原理建立的皮膚試驗，具有快速、簡單、低成本的優點，但特異性較低，曾接種卡介苗(BCG)或接觸非結核分枝桿菌的環境均可導致TST假陽性。

2.3 γ-干擾素釋放試驗技術IGRAs原理為機體初次感染結核分枝桿菌后致敏T淋巴細胞，再次感染時γ-干擾素在內的細胞因子釋放，通過檢測γ-干擾素判斷感染狀況。劉珍敏等[6]對299名兒童研究對象進行結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）、涂片檢查，與TST比較靈敏度和特異度，結果顯示T-SPOT.TB靈敏度遠高于TST，且標本獲取方便，能快速診斷。

雖然IGRAs具有較好的診斷價值，但測試費用昂貴，對實驗室設備要求較高，給結核病高負擔國家帶來較大壓力。WHO在2022年發表的報告中指出[7]：基于特定抗原的新結核桿菌抗原皮膚試驗(TBSTs)已經開始被研究，這些試驗結合更簡單的皮膚試驗和高特異性的IGRAs，將可能成為結核感染診斷的有效工具。

2.4 EC皮膚試驗技術2021年的一項研究顯示：EC皮膚試驗與T-SPOT.TB試驗相比，EC皮膚試驗顯示出較高的特異性和靈敏度，具有良好的安全性和較高的診斷準確性[8]。此外，EC皮膚試驗在HIV感染者診斷中也顯示出價值，無論是否接種卡介苗，EC皮膚試驗對HIV感染者均有較高的診斷價值。因此，EC皮膚試驗可能是一種有效的替代診斷試驗，用于HIV流行率高和卡介苗接種高的環境或人群，但尚未得到系統的審查，因此還需進一步研究。

3 結核病分子生物學檢測

早診斷、早隔離、早治療能夠減少肺結核發病和死亡，但MTB生長緩慢，通過傳統實驗室檢查難以快速確診，而分子生物學診斷可更快地進行病原檢測。目前，應用分子生物學診斷結核病的方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）技術、環介導等溫擴增（LAMP）技術、線性探針分析 (LPA)技術、基因芯片技術、基因組測序技術、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術等。

3.1 聚合酶鏈式反應技術PCR通過在體外模擬體內DNA復制的過程獲得大量DNA，包括變性、退火、延伸三個階段。PCR是傳統的分子生物學檢測方法，成本低、方法成熟、有較好的檢出率，但存在易污染、非特異性擴增、會導致假陽性等缺點。因此產生了很多改進的方法，例如即時檢驗（point of care testing，POCT）技術、熒光定量（real-time）PCR技術、數字 PCR (digital PCR，dPCR)技術。

3.1.1 即時檢驗技術 POCT是一種集核酸提取、檢測、擴增為一體的新型結核分子診斷技術，無需在特定的分子實驗室操作，該技術主要用于門診及住院的疑似結核病患者初篩及鑒別診斷中，可在2 h內從痰液等樣本中檢測是否存在結核分枝桿菌復合群，能夠極大提高結核病病原學陽性率，更好地服務于臨床并提高診療水平。于佳佳等[9]首次成功建立并驗證了針對MTB的PCR-CRISPR檢測技術具有敏感度與特異度高、穩定性好、成本低等特點。基于CRISPR/Cas的超敏診斷技術為TB診斷提供了可能，且可能適合于POCT。

3.1.2 熒光定量PCR技術 Gene Xpert MTB/RIF檢測是基于實時熒光定量PCR原理的一種檢測技術，可在2 h內檢測樣本中是否存在結核分枝桿菌及是否耐藥，是目前最快的結核病分子診斷技術之一，可以準確地排除非結核分枝桿菌，并分離鑒定出RIF抗性。該方法操作簡便、檢測準確性高、污染概率小，但價格昂貴、培養陰性菌量少且對HIV患者的靈敏度不夠。為彌補這些不足，Gene Xpert MTB/RIF Ultra（簡稱Xpert Ultra）增加了兩種MTB檢測分子靶標(IS1081 和IS6110)以提高檢測靈敏度，并且有更低的TB檢測限（LOD），與Gene Xpert MTB/RIF特異性相當[10]。因此Ultra可顯著提高結核病的檢測率，尤其是對于低細菌性患者。對于肺外結核的診斷，一項研究顯示Xpert Ultra對76例行CSF培養的結核性腦膜炎患者檢測敏感度明顯高于MGIT 960培養[11]。此外，Xpert Ultra在HIV陽性患者中表現出高靈敏度。Xpert Ultra 在標本含菌量少、肺外結核和艾滋病合并結核患者中的靈敏度較好。自2021年來，WHO建議將糞便與痰一起作為一種標本類型用于Xpert Ultra檢測結核病的初始測定，可在緊急情況時作為首選方法[12]。對于兒童來講，痰液難以獲得，可選擇糞便代替檢測，但該技術特異性較低，且成本較高，還需進一步研究。

3.1.3 數字 PCR技術 dPCR是一種比熒光定量PCR具有更高靈敏度和絕對定量的微量DNA鑒定技術，是基于單分子PCR方法進行計數的核酸定量，絕對定量不受標準曲線影響，具有高靈敏度、低樣本需求量低、高耐受性等特點。研究顯示可使用dPCR來調查MTB的異耐受性，通過對katG和rpoB基因進行熒光定量PCR突變檢測，確定結核分枝桿菌的異質性耐藥率，這兩種基因通常分別與異煙肼和利福平耐藥有關[13]。微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）能夠檢測出突變株和野生型菌株，這使其成為早期診斷和管理耐藥結核病的寶貴工具，同時也印證早期發現和管理耐藥結核病對于控制結核病進展的重要性。數字PCR技術還未能獲得大量臨床研究，這也有可能是與其儀器設備和試劑昂貴有關，還需進一步研究。

3.2 環介導等溫擴增技術LAMP技術是一種新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、操作簡便的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上優于PCR技術。其不依賴熱循環設備而實現高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。但因其靈敏度高，開蓋容易形成氣溶膠污染，易造成假陽性。有研究將LAMP技術與傳統方法（涂片鏡檢和MGIT 960）相比，結果顯示TB-LAMP檢測MTB的效能更高,且涂片鏡檢和TB-LAMP并聯合檢測肺泡灌洗液的敏感性更好[14]，這提示LAMP技術可作為診斷兒童肺結核的替代試驗。對于結核性腦膜炎的診斷，LAMP技術陽性率高、耗時短，能早期獲得結果[15]，表明LAMP技術對于早期診斷結核性腦膜炎具有較好的參考意義。

3.3 線性探針分析技術LPA技術是通過應用生物素標記引物進行DNA的擴增，將擴增產物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針進行雜交，通過酶聯免疫顯色法顯示結果，其是耐多藥結核病檢測方法之一。該方法具有較高的靈敏度和特異度，且檢測速度快。利用該技術的儀器比較有代表性的為INNO-LiPA Rif.TB和MTBDRplus。2008年WHO批準使用一線探針法基因型MTBDRplus v1.0，用于快速檢測耐多藥結核病(MDR-TB)；2011年，新版本的LPA技術出現基因型MTBDRplus v2.0[16]。二線結核病藥物耐藥性基因（基因型MTBDRsL v2.0）2015年出現，用于檢測與氟喹諾酮(FQs)和二線注射藥物(SLDIs)耐藥性相關的突變，Singh等[17]研究表明基因型MTBDRsL v2.0檢測FQ和SLIDs的特異性分別為92.31%和100.00%，靈敏度為100.00%。MTBDRsL是目前可檢測廣泛耐藥結核的分子診斷技術，但是該方法的成本較高，仍是耐多藥結核病高負擔國家的問題之一。

3.4 基因芯片技術基因芯片又稱DNA芯片，測序原理為雜交測序法，通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定，得出一組序列完全互補的探針序列，進而重組出靶核酸的序列。該方法將多種探針固定在支持物上，可一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，具有自動化程度高、操作序列多、檢測效率高的優點，可用于菌種的鑒定及耐藥性檢測。2018年，有研究證明生物芯片技術對RIF和INH耐藥及耐多藥結核病檢測具有良好的敏感度和特異度，值得在我國臨床推廣[18]。其中生物芯片對RIF檢測的敏感度為86.08%，特異度為97.7%；對INH耐藥的敏感度為79.36%，特異度為98.71%，對MDR-TB檢測的敏感度為78.01%，特異度為98.86%。此外，對于涂陽肺結核患者MTB菌種鑒定，基因芯片法對結核分枝桿菌復合群鑒定符合度為100.00%，可較好的鑒定結核分枝桿菌菌種，并與常規菌培養結果具有高度一致性[19]。相較于痰涂片、痰培養方法，基因芯片技術可提高陽性檢出率，但是基因芯片仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術成本昂貴、復雜、重復性差、分析泛圍較狹窄等，還需進一步研究。

3.5 基因組測序技術基因測序是一種新型基因檢測技術，主要測序原理是循環微陣列法。其可以預測多種疾病，是將提純化后的基因組核酸使用高通量測序儀進行測序，獲取細菌基因組DNA序列。靶向二代測序（TNGS）可應用于結核分枝桿菌復合體耐藥性相關基因突變中，識別耐藥性[20]，以糞便為標本并為難以提供呼吸道標本的肺結核患者提供了獲得關鍵診斷信息的機會。宏基因組二代測序（mNGS）由于其全面性，被認為是可能取代傳統方法的微生物學方法，是一種很有前途的傳染病檢測技術，mNGS診斷結核病經meta分析的靈敏度和特異度分別為70%和99%[21]。全基因組測序（WGS）可獲得詳細的細菌全基因序列,分析耐藥基因突變從而預測其耐藥表型。WGS可以是結核病耐藥監測和確定治療方案的一種重要方法，雖有明顯優勢，但是由于操作繁瑣且價格高昂，僅在發達國家及低負擔結核病國家開展。

3.6 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術MALDITOF MS是近年發展起來的一種質譜技術，已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物及多種合成聚合物的強有力工具。其主要對微生物的核糖體蛋白組進行分析，形成不同的指紋圖譜，與數據庫中已知菌種的鑒定譜圖進行統計學聚類分析，獲得未知樣本的鑒定結果。該方法具有靈敏度高、準確度高、分辨率高、圖譜簡明、質量范圍廣及速度快等特點，且可大量檢測。MALDI-TOF MS診斷肺結核涂陰或無痰肺結核敏感度為68.5%[22]，優于其他方法，有較好的應用前景。與基因芯片相比，MALDI-TOF MS分析時間短、簡單、快速、成本低且可以區分結核分枝菌與非結核分枝菌。此外，MALDI-TOF MS也可用于結核分枝桿菌耐藥性評估。MALDI-TOF MS技術在MTB藥敏檢測中表現出良好的靈敏度和特異度，但其無法鑒定不能被培養的細菌，只能鑒定培養陽性的細菌，可以作為臨床判斷的補充。

4 結核病組學相關研究進展

近年來，結核病組學研究發展迅速，其較高的特異度及靈敏度為進一步快速診斷結核病、區分潛伏性肺結核（LTBI）與活動性肺結核（ATB）提供強有力的支持，為深入了解結核病的發病機制、耐藥機制及尋找新的治療靶點提供了重要的幫助，具有較好的臨床應用前景。在結核病的組學研究中，基因組學研究是最早開展的領域之一，通過使用高通量DNA測序和生物信息學來分析整個基因組的功能和結構。在1998年首次對結核分枝桿菌H37Rv菌株進行了全基因組測序，結果顯示基因表達產物中40%蛋白質有精確的功能[23]。如今隨著技術不斷發展，現在已經有許多改良的新方法，前文已詳細表述過，現不作過多敘述。

4.1 基于轉錄組學的生物標志物轉錄組學是從RNA水平篩選結核相關的特異性差異表達基因，從而確定生物標志物，可有效預測結核病進展。研究篩選出的3個轉錄標志(FCGR1A、ZNF296和C1QB)可區分ATB和LTBI[24]，其中AUC為97.3%，為結核病患者靶向治療提供可能。此外對于耐藥檢測具有重要意義，2021年的一項研究顯示7個基因(TRIM1、9、21、32、33、56、66)能夠區分利福平耐藥菌株的感染，為RR-TB的發病機制提供了新的實驗基礎[25]。

4.2 基于蛋白組學的生物標志物蛋白組學通過分析正常與病理個體之間蛋白質組的差異，為疾病找到新的診斷途徑，設計新的治療靶點，利用蛋白組學篩選結核病生物標志物提高結核病診斷準確性。結核病相關蛋白質可作為潛在的診斷標志物用于區分 LTBI 和ATB。賀仁忠等[26]篩選出8個蛋白標志物，其中Rv1441c、R0494可作為鑒別LTBI和ATB的候選標志物。Yang等[27]篩選出8個蛋白生物標志物（I-TAC、I-309、MIG、顆粒溶素、FAP、MEP1B、弗林蛋白酶和LYVE-1），在區分結核和非結核的驗證隊列中AUC為0.915，特異度為84%，敏感度為75%。2021年對161名參與者痰液進行分析，發現a-1-酸性糖蛋白兩種亞型（即：ORM1和ORM2）在TB抗原檢測時顯著增加，可能成為肺結核顯著的生物標志物[28]。

4.3 基于代謝組學的生物標志物代謝組學是研究生物系統在特定條件下的整體代謝水平，可揭示結核病發病和耐藥過程中代謝產物的變化，從而發現新的治療靶點。2022一項研究通過GC-MS和LC-MS/MS分析研究結核分枝桿菌感染對血清代謝組的影響，發現了7種代謝物在區分肺結核患者與健康組時表現出較好的性能，可能成為新的生物標志物[29]。Berney等[30]利用代謝組學技術研究發現，宿主體內S-腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的消耗可導致MTB無法增殖和死亡，因此為開發有效的抗結核化療提供了極好的靶點，但作用機制未完全清楚。代謝組學研究目前比較少，因此可以通過多組學聯合分析，更全面地了解結核病菌在感染過程中的作用機制，從而發現更多的治療靶點。

5 小結

綜上，當前結核病的實驗室診斷方法種類非常多，從傳統的試驗方法到現在的測序等，有著全方位的研究和探索。各種方法原理上有較大差異，在結核病診斷中需要綜合運用多種技術和手段，包括痰液檢測、血液檢測、免疫學診斷和分子生物學診斷等。臨床需根據各種診斷方法的優缺點選擇最佳方法，而診斷技術也需不斷發展和完善，找到一個具有高靈敏度、高特異度、更加可靠的方法。對于兒童、免疫功能低下等患者，目前診斷及治療還需進一步研究。