遵義市食源性沙門菌分子分型及耐藥研究*

韋德琴,朱 琳

貴州省遵義市疾病預防控制中心檢驗科,貴州遵義 563000

沙門菌廣泛存在于自然界,是全球食源性腹瀉病最常見的病原菌之一,可引起胃腸炎、類傷寒、敗血癥、局部化膿性感染等疾病。據世界衛生組織報告,沙門菌造成的食物污染給世界各國帶來了巨大經濟損失,并且嚴重威脅著人們的身體健康和生命安全。由于沙門菌種類多達2 600多種型別[1],傳統分型鑒定技術需要實驗室保存250多種不同的高質量分型血清和350種不同的抗原[2],并且要求實驗人員經驗豐富,技術水平高,除此之外該試驗周期長、精確度差,加大了社會各檢疫部門對食品中沙門菌的防治及監控的難度。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是基于分子的快速分型方法,可提供更快、差異性更明顯和更準確的沙門菌分型,克服了傳統血清分型的局限性,目前被認為是細菌分型的“金標準”,已被公共衛生部門和食品監管機構用于疫情調查和溯源分析。目前,抗菌藥物聯合應用是臨床治療沙門菌病的主要措施,由于抗菌藥物的濫用出現了許多多重耐藥細菌、泛耐藥細菌以及全耐藥超級細菌,沙門菌作為重要的致病菌,其耐藥性不容忽視[3]。本研究對遵義市食品來源的21株沙門菌進行血清分型、PFGE分子分型和藥敏試驗,為食源性沙門菌監測與溯源提供理論依據,同時為沙門菌感染病例合理使用抗菌藥物、規避引發耐藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1一般材料 本試驗分析的21株沙門菌均分離自遵義市2020-2022年紅花崗區、務川縣、鳳岡縣、余慶縣、道真縣、赤水市、綏陽縣、桐梓縣、湄潭縣、仁懷市10個區縣食品風險監測項目標本。PFGE試驗標準菌株為沙門菌H9812,取自貴州省疾病預防控制中心細菌科。藥敏試驗質控菌株ATCC25922、ATCC27853均取自貴州省疾病預防控制中心細菌科。

1.2儀器與試劑 沙門菌顯色平板、營養瓊脂、XLD瓊脂均購自北京陸橋技術股份有限公司;沙門菌屬診斷血清購自丹麥國家食品研究所;限制性內切酶XbaⅠ購自 TaKaRa公司;蛋白酶K、Gelred染液購自索萊寶公司;脈沖場凝膠電泳儀、顯影儀購自Bio-Rad公司; CHNENF革蘭陰性菌藥敏板及配套試劑、Sensitire AIM自動菌液加樣系統及分析系統均購自賽默飛公司;質譜儀鑒定儀購自布魯克公司。

1.3方法 沙門菌血清型鑒定是根據White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對21株沙門菌進行O抗原和H抗原血清凝集試驗確定菌株的血清型別。PFGE分子分型參照美國Pulse Net PFGE標準化方法進行,將21株分離的沙門菌株用限制性內切酶XbaⅠ酶切后進行PFGE,膠塊經Gelred染液染色后成像。藥敏試驗按照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測沙門菌對17種抗菌藥物(氯霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟、頭孢他啶、四環素、環丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、鏈霉素、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、多黏菌素、頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環素)的藥物敏感性,根據CLSI抗微生物藥敏試驗執行標準M100[4]的相應標準獲得敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結果,替加環素目前在M100標準里無R、S的判斷標準,其R、S的判斷參考文獻[5]。

1.4統計學處理 采用BioNumerics軟件進行聚類分析,構建聚類樹。

2 結 果

2.1沙門菌血清分型 對21株沙門菌進行血清學鑒定,共鑒定出16種血清型,以C群(8株)、D群(5株)、E群(5株)為主,分別占38.10%、23.81%、23.81%,其中肯塔基沙門菌3株、德爾卑沙門菌2株、腸炎沙門菌2株、希林登沙門菌2株,其余均為1株,見表1。

表1 21株食源性沙門菌血清型分布

2.2沙門菌PFGE分子分型 沙門菌用限制性內切酶Xba Ⅰ酶切后進行PFGE試驗,結果顯示DNA片段得到較好的分離,可見大小不一的電泳條帶,見圖1。但菌株之間的相似性不高,同一血清型同源性也不高,其中2株肯塔基沙門菌同源性為62.96%,2株希林登沙門菌同源性為53.85%。

圖1 21株食源性沙門菌PFGE聚類分析圖譜

2.3藥敏試驗結果 藥敏試驗結果顯示80.95%沙門菌對17種抗菌藥物存在不同程度的耐藥,見圖2。多重耐藥率達76.19%,其中1株吉韋沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門菌對11種抗菌藥物耐藥。多重耐藥情況見表2。21株沙門菌對氨芐西林的耐藥率最高,為71.43%,其次是四環素(61.90%)、復方磺胺甲噁唑(61.90%)、鏈霉素(57.14%)、氯霉素(52.38%),對頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環素敏感率均為100%,對頭孢噻肟和頭孢他啶也表現出了一定的耐藥性。

注:由于鏈霉素在體外可能表現為有活性,但臨床治療無效,目前M100標準里沒有規定鏈霉素敏感耐藥濃度,本文劃分為S≤4,R≥3。

表2 21株沙門菌耐藥譜

3 討 論

沙門菌被列為首選控制的食源性致病菌,其引起的食源性疾病是危害人類健康的重大隱患[6]。研究顯示,在世界范圍內由沙門菌引起已確診的患病人數顯著增加,目前沙門菌每年導致歐洲有超過10萬人患病,引起美國1 200萬人感染、1.9萬人住院甚至450人死亡[7],也是引發我國食物中毒的首要微生物。據資料統計,在我國細菌性食物中毒中,70%～80%是由沙門菌引起,而在引起沙門菌中毒的食品中,90%以上是肉類等動物性產品。遵義市近年來在食品中頻繁檢出沙門菌,且檢出的沙門菌血清型復雜多樣,導致遵義市近年來頻繁發生一些由罕見血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件。因此本研究初步研究了2020-2022年分離的21株食源性沙門菌的分型及藥敏試驗結果,為社會防疫部門進行防疫和食物中毒患者的治療提供理論依據。

沙門菌血清學分型種類繁多,達2 600多種血清型,在不同國家和地區的分布有差異性。在印度,鼠傷寒沙門菌、雞沙門菌和腸炎沙門菌是最流行的血清型,占分離株的96.2%[8];在埃及,腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌是最常見的血清型[9];在日本,肉雞樣本中僅存在嬰兒沙門菌、曼哈頓沙門菌和胥伐成格隆沙門菌[10];在我國福建省、濟南市、聊城市、成都市等地的腹瀉標本中,鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌均為優勢血清型[11-14],而國內食源性疾病中沙門菌最常見的血清型是鼠傷寒、豬霍亂、都柏林、德爾卑、腸炎等沙門菌[15]。本研究中21株沙門菌來源于10個不同區縣,共鑒定為16種血清型,分布于B、C、D、E群,種類重復率低,無地區特異性。PFGE試驗結果顯示,用限制性內切酶Xba Ⅰ酶切電泳后,DNA片段可得到了較好的分離,分離率達100%,但菌株之間的相似性不高,其中2株肯塔基沙門菌同源性為62.96%,2株希林登沙門菌同源性為53.85%。結果說明沙門菌PFGE型別與血清型之間的關聯性并不明確,這與崔可琦等[16]報道的冰鮮雞生產鏈中同種血清型沙門菌可分布在多個PFGE譜型內一致。以上結果提示遵義市食品中存在多種型別的沙門菌,食品中沙門菌污染源廣泛、復雜多樣,應加大對沙門菌的防治及監控力度。

雖然沙門菌病通常是一種自限性疾病[17],但該疾病可以全身性傳播并退化為慢性疾病,如反應性關節炎、骨髓炎、心臟炎癥或神經疾病[18]。氨芐西林、氯霉素和甲氧芐啶-磺胺甲噁唑是臨床治療沙門菌病的主要藥物[3,19],但多年來由于抗菌藥物的不合理使用,使得沙門菌對抗菌藥物耐藥現象越來越嚴重[20],并且存在多重耐藥的問題。本研究21株沙門菌耐藥率達80.95%,多重耐藥率達76.19%,對青霉素類耐藥率最高,對四環素和磺胺類抗菌藥物耐藥性強。這與我國沙門菌耐藥趨勢一致,現有研究數據顯示其耐藥機制為相關耐藥基因tem、tet、sul分別通過編碼β-內酰胺酶、外排泵和氫葉酸合成酶介導氨芐西林、四環素和磺胺類抗菌藥物耐藥。目前,臨床應用頭孢菌素類抗菌藥物治療細菌性感染較為普遍,本研究中部分菌株對于頭孢他啶/頭孢噻肟耐藥現象不容忽視。針對頭孢他啶/頭孢噻肟的耐藥研究,21世紀初美國科學家研究發現攜帶bla頭孢菌素抗性基因的沙門菌在大洋洲、亞洲、非洲-中東和歐洲等地已經出現,其耐藥機制還不明確,可能與bla基因突變誘導外排泵的過表達、外膜蛋白表達減少以及導致外膜蛋白丟失的基因突變有關[21]。除此之外本研究中存在1株吉韋沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門菌對11種抗菌藥物耐藥,其廣泛的耐藥現象需要進行深入研究。

本研究分析的沙門菌分離自2020-2022年食品風險監測項目標本,菌株量較低,還需增加菌株數才能得到更為準確的結論,為沙門菌病患者用藥提供支持。但現有數據提示遵義市沙門菌污染源廣泛,耐藥現象嚴重,提示在各類食品生產和銷售中都需要保持警惕和嚴格監管。