全外顯子組測序診斷Rothmund-Thomson綜合征的臨床研究

王曉玲,郭若蘭,王江濤,郭 俊,陳元穎,郝嬋娟

1.鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院小嬰兒病房,河南鄭州 450000;2.北京市兒科研究所出生缺陷遺傳學研究北京市重點實驗室/國家兒童醫學中心遺傳與出生缺陷防治中心/兒科重大疾病研究教育部重點實驗室/首都醫科大學附屬北京兒童醫院,北京100045

Rothmund-Thomson綜合征(RTS)是一種少見的常染色體隱性遺傳病,1868年由德國眼科醫生Rothmund 首次報道,后由英國皮膚科醫生Thomson 等相繼描述。RTS主要臨床表現為皮膚異色癥,毛發稀疏,腹瀉,骨骼發育異常或畸形,指甲營養不良或牙齒異常,矮小,青少年白內障,早衰,高腫瘤風險等[1]。目前研究認為該病發生與 RECQL4基因(OMIM:603780;NM_004260.3)突變有關,人類基因突變數據庫(HGMD)已收錄該基因致病或可能致病變異141個,包括錯義突變、無義突變、剪接位點突變、小的插入/缺失突變等多種變異類型。本研究通過高通量測序對河南省兒童醫院小嬰兒病房收治的1例先天多發畸形患兒進行一家三口全外顯子組測序,基因結果提示該患兒攜帶2個RECQL4基因新突變,分別來自父母雙方,最終確診為RTS。現將該病例報道如下,以提高對該病的認識,并豐富RECQL4基因突變譜。

1 臨床資料

1.1一般資料 患兒,女,3月24 d,以“腹瀉3月余,咳嗽10 d”為代主訴入院;患兒生后數天即出現腹瀉,呈黃色稀糊狀便,≥10次/天,量少。體質量增長差,先后在當地醫院及診所治療,間斷口服腸道益生菌、蒙脫石散等治療(具體用藥及劑量不詳),患兒腹瀉無好轉。10 d前患兒出現咳嗽,呈陣發性連聲咳,3～5聲/次,≥10次/天,有痰不易咳出,無發熱、喘息、呼吸困難等,病初在家自行口服金振口服液、氨溴特羅口服液等治療3 d,效果差,后至當地醫院住院治療,診斷為“支氣管肺炎”,治療6 d,給予哌拉西林/他唑巴坦、氨溴索等藥物輸注(具體用藥劑量不詳),患兒咳嗽無明顯好轉,遂轉至河南省兒童醫院就診。門診以“支氣管肺炎”收入院。發病來,患兒精神反應一般,食欲欠佳,大便稀,≥10次/天,小便量減少。患兒系孕40周+1生產,出生體質量2 kg,出生后人工喂養,出生后因低出生體質量、四肢畸形在當地新生兒科住院治療1周,好轉出院。

入院查體:體質量3.2 kg,身長56 cm,神志清楚,精神反應差,營養不良貌,皮下脂肪菲薄,毛發稀疏,面色蒼白,顏面部、臀部可見較多片狀色素減退斑,雙下肢可見2處咖啡牛奶斑,頭顱無畸形,頭圍36 cm,前囟平軟,直徑0.8 cm×0.8 cm,口唇稍蒼白,口腔黏膜光滑,無高腭弓,頸軟,胸廓對稱無畸形,三凹征陰性,雙肺呼吸音粗,可聞及粗濕啰音,心音有力,HR 140次/分,律齊,心前區可聞及2/6級柔和收縮期雜音,腹軟,肝脾肋下未觸及,未捫及包塊,腸鳴音正常,四肢末梢暖,雙手拇指關節缺如,僅有皮瓣與手掌相連,雙手其余四肢及雙足趾關節無明顯畸形,四肢肌張力低,腱反射未引出,不會豎頭,追視追聽未引出。 見圖1～5。

圖1 患兒就診時顏面部色素脫失斑

圖2 患兒就診時臀部色素脫失斑

圖3 1月后隨訪時患兒顏面部皮疹改變

圖4 1月后隨訪時患兒臀部皮疹改變

圖5 患兒手指發育畸形

入院檢查:血尿糞常規、生化全套、甲狀腺功能5項、血氨、血氣分析、血尿遺傳代謝檢查均未見明顯異常。痰培養顯示:大腸埃希菌。心臟彩超顯示:卵圓孔未閉,輕度肺動脈高壓;腹部彩超未見異常。四肢X線片未見關節脫位及骨骼發育異常。

1.2基因檢測方法 經患兒父母知情同意和河南省兒童醫院倫理委員會批準,使用EDTA抗凝真空管采集患兒及其父母外周血各2 mL,利用天根生化科技有限公司血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)進行基因組DNA提取。對患兒及父母基因組DNA,利用Agilent SureSelect人外顯子組V6捕獲試劑盒構建文庫,使用Illumina Nova 6000測序平臺進行2×150 bp雙端測序。測序數據經質量控制、冗余數據過濾、基因組參考序列比對等,得到患兒及父母全外顯子組的SNV及Indel等突變。應用千人基因組數據庫(1 000 Genomes)、ExAC、gnomAD等人群數據庫過濾等位基因人群頻率大于5‰的突變,應用多個在線預測軟件(MutationTaster、SIFT、Polyphen-2、NNSPLICE等)預測基因突變的有害性,查閱ClinVar、HGMD數據庫以及PubMed中相關文獻報道,并依據美國遺傳學會(ACMG)2015年發布的致病變異分級指南[2],綜合判斷突變致病性。

1.3測序結果 一家三口全外顯子組高通量測序結果提示,患兒攜帶RECQL4基因復合雜合突變:c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC,分別遺傳自患兒父親和母親,并且通過一代測序進行了驗證(圖6)。

圖6 一代測序驗證結果

筆者查閱dbSNP數據庫、千人基因組數據庫、ExAC數據庫以及gnomAD數據庫,未發現以上2個突變的人群頻率報道,提示均為罕見變異。檢索HGMD、Clinvar數據庫以及PubMed,未見到2個突變的致病病例報道,鑒定為RECQL4基因的2個新突變。根據美國遺傳學會(ACMG)2015年發布的致病變異分級指南,c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC突變均滿足PVS1、PM2、PP3的致病性證據,評級為致病變異。綜合患兒臨床表型及RECQL4基因結果,確診為RTS。

2 文獻復習

分別以Rothmund-Thomson綜合征、RECQL4基因、Rothmund-Thomson syndrome、RECQL4為檢索詞,在中國知網、萬方數據庫、PubMed數據庫進行中英文文獻檢索(檢索時間從建庫至2023年8月)。共檢索到中文文獻10篇,英文文獻131篇,目前共報道RTS病例 400余例[3]。

2.1成因 約60%的RTS是由RECQL4突變導致,10%的RTS是由ANAPC1 突變導致[4];通過分子遺傳學檢測,到目前為止RTS分為2種臨床亞型:RTS-Ⅰ型是不常見的亞型(35%～40%),與ANAPC1 基因突變相關[5],臨床特征包括皮膚異色癥、外胚層發育不良和青少年白內障。RTS-Ⅱ型較常見(60%～65%),是由于RECQL4基因復合雜合突變或純合突變導致。其臨床特征為皮膚異色癥、先天性骨缺損和高腫瘤風險[6-7]。

2.2診斷 RTS的診斷取決于臨床表現和(或)雙等位基因的致病變異。RTS 被認為是一種累及多系統的遺傳性皮膚病,高達90%的患者皮膚損害表現為面部紅斑、水腫以及臉頰上的水皰,在出生后的最初幾個月可能會延伸至耳郭、前額、頸部和四肢。隨著患兒的生長,皮膚異色癥的特征性病變(毛細血管擴張、萎縮、色素沉著過度或色素沉著不足的斑塊)會出現,并持續存在;30%的病例可能會出現掌跖角化過度,30%的病例會出現頭發和指甲的異常,主要表現為頭發細、頭發稀疏、局部脫發、指甲營養不良或無甲。其他癥狀包括身材矮小、骨骼畸形、牙齒發育不全、性腺功能減退、白內障、缺損或圓錐角膜[8]。對于臨床表現提示為RTS的患者應盡早進行分子診斷。

2.3高腫瘤風險 RECQL4基因突變會導致基因組不穩定,增加惡性腫瘤風險。SIMON等[9]提出,RECQL4截短突變的患者發生癌癥的風險較高。骨肉瘤的患病率約為30%,皮膚癌(鱗狀細胞癌)的患病率約為5%,其他腫瘤包括惡性纖維組織細胞瘤、基底細胞癌、鮑文氏病、骨髓增生異常、急性髓系白血病[10]。

3 討 論

RTS多在 3～6個月發病,典型的臨床表現為皮膚異色癥,皮膚異色多開始于面部,逐漸發展至四肢、臀部[11]。嬰兒期可出現胃腸道癥狀,包括長期嘔吐腹瀉,生長落后,毛發稀疏,牙齒萌出延遲或齲齒,指甲營養不良,骨骼發育障礙(表現為橈骨缺失或發育不良、拇指缺失等)。約 40%患者4～7歲時發生白內障,晶狀體渾濁伴角膜變性;部分患者智力發育正常或低下,性腺發育不良或功能低下[12]。骨肉瘤或其他惡性腫瘤的發病率明顯增高[13]。本例患兒發病早,主要表現為面部、臀部皮膚異色癥樣改變,腹瀉,拇指畸形,生長發育遲滯,毛發稀疏。隨訪1月后皮膚異色癥加重,呈大理石樣外觀,生長發育明顯落后于同齡兒,乳牙未萌出;尚未出現白內障,骨肉瘤及其他惡性腫瘤等,后期需長期隨訪。

RTS 與Baller-Gerold綜合征(BGS)和Rapadilino綜合征在臨床表型上有重疊現象[14]。BGS是一種罕見的伴有橈骨發育不全和顱縫早閉的常染色體隱性遺傳病(OMIM 218600),其臨床表現為顱縫早閉,橈骨缺損,生長遲滯[15]。Rapadilino綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳綜合征,其命名來源于主要臨床特征的首字母縮略詞,包括橈骨發育不良或缺如、髕骨缺如、腭裂或高腭弓、腹瀉、關節脫臼、身材矮小、肢體畸形、鼻子細長,智力正常,發病者多為芬蘭人[16]。RTS與Rapadilino綜合征鑒別點為皮膚異色癥;具有特征性的皮膚異色癥可被認為是RTS的特殊表現[17]。RTS與BGS的鑒別點為后者存在顱縫早閉[18]。但RECQL4基因突變可出現在這3種疾病中,因此,以上綜合征中的基因型與表型之間的相關性需要進一步研究。

RECQL4基因定位在常染色體8q24.3,有21個外顯子,編碼包含1 208個氨基酸的RECQL4蛋白,屬于RECQ DNA解旋酶家族成員,其功能為在DNA復制和修復過程中解開DNA雙鏈。RECQL4基因在保持DNA穩定及DNA代謝等多個方面有重要作用[19]。 在過去幾年積累的證據表明,RECQL4不僅在癌癥發生、發展中起關鍵作用而且在早衰過程中也發揮重要作用[20]。

研究表明,RECQL4基因突變是大多數RTS病例的發病原因。本例患兒RECQL4基因攜帶2個雜合突變:c.3237-2A>T和c.1593_1594delTC,分別來自其父親和母親,為復合雜合突變,符合常染色體隱性遺傳規律。 c.3237-2A>T為剪接位點變異,位于19號外顯子5′端上游-2位,是經典的剪接受體位點。通過NNSPLICE 0.9 version(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)、Human Splicing Finder 3.1(http://www.umd.be/HSF/HSF.shtml)等在線軟件預測,該位置突變可導致剪接受體位點喪失,發生剪接異常。c.1593_1594delTC位于9號外顯子,為小的缺失突變,可引起基因的編碼閱讀框發生框移突變。該突變位置序列在多個物種間高度保守,可導致編碼氨基酸第533位由亮氨酸突變為丙氨酸,并在突變第6位提前出現終止密碼子。基因突變后的產物RNA預計會通過“無義介導的mRNA衰減”機制降解或產生截短蛋白,從而導致等位基因的活性大部分喪失。同時,通過公共數據庫與已發表文獻的檢索,本病例報道的2個突變均為之前未報道的新突變,豐富了RECQL4基因的突變譜。

4 面臨的問題

從首次描述這種疾病至今 100 多年間,大約在60%的RTS患者中觀察到RECQL4基因突變,10%的RTS 患者存在ANAPC1突變,因此約30%的患者仍未確診致病基因,新 RTS 致病基因的鑒定在近些年停滯不前。另外,RTS患者的RECQL4基因突變具有罹患惡性腫瘤的高風險,早期發現腫瘤對患者預后及預期壽命有重要影響。由于這種疾病的罕見性,目前尚未為 RTS-Ⅱ型患者制定規范的癌癥監測方案。

5 展 望

隨著測序技術的發展,與RTS相關的新的基因將會被鑒定。而基因型與表型的差異,不同基因變異如何導致相似的臨床表現,RTS相關基因背后是否存在共同機制?這些問題是進一步研究這種復雜疾病背后的分子和病理生理機制的方向。

綜上所述,RTS綜合征是以皮膚異色癥為主要表現、并累及多個系統的罕見遺傳病,部分患者有白內障、脫發、骨質減少等早衰表現及腫瘤易感性[13],生存期目前尚缺乏相關數據。RECQL4基因突變檢測有助于確診本病,基因型與表型之間的關聯性仍需進一步研究。