懸移質(zhì)泥沙-微囊藻毒素復(fù)合體對大型溞的毒性效應(yīng)

馮琴霜,黃 維,何 強,李 宏(重慶大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,重慶 400045)

泥沙是水生生態(tài)系統(tǒng)中一種重要的環(huán)境介質(zhì),能為污染物從水相到固相與水體到生物體等多種途徑的遷移充當(dāng)載體.在水庫泄水期時,河流沉積物表層輕質(zhì)細(xì)顆粒泥沙在水流裹挾作用下進入水環(huán)境,演變成為懸移質(zhì)泥沙(SPM).相較于其他類型泥沙而言,SPM 具有更大的比表面積,能為水環(huán)境中污染物的附著提供更多的吸附位點,進而影響水體中污染物的遷移轉(zhuǎn)化[1].

微囊藻毒素(MCs)是由產(chǎn)毒微囊藻合成并釋放到水生環(huán)境中的一種有毒物質(zhì)[2-3].當(dāng)藻細(xì)胞受到脅迫或衰亡而發(fā)生破裂時,細(xì)胞內(nèi)的MCs 會進入水生態(tài)環(huán)境中,并通過皮膚接觸或者食物鏈富集等方式進入水生生物或人體內(nèi),從而對水生生物及人體健康造成傷害[4-7].占水體中MCs總濃度46%～99.8%的異構(gòu)體MC-LR[8]是最普遍、分布最廣、毒性最強的一種異構(gòu)體[9].研究發(fā)現(xiàn),MC-LR 對大型溞的48h 半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為13.46mg/L[10],且MC-LR 暴露造成大型溞能量損傷,其中7d 齡大型溞毒素生物轉(zhuǎn)化能力更強,而3d 齡大型溞抗氧化應(yīng)激能力更強[11].

研究表明,水體中超過81%的MCs 可通過吸附作用去除[12-13].而SPM 所具有的粒徑小、比表面積大、重量輕等特點使其成為了一種很好的污染物載體.研究發(fā)現(xiàn)河流中的泥沙對環(huán)境中的有機物具有很強的吸附親和力,是環(huán)境中污染物重要的匯[14],且懸浮顆粒物的大小會影響大型溞的攝食[15].目前鮮有研究評估SPM吸附MC-LR所得到的復(fù)合體的生態(tài)毒性效應(yīng).

本研究通過吸附動力學(xué)實驗制備了不同MCLR 吸附量的SPM-MC-LR 復(fù)合體,并對水生態(tài)毒理模式生物大型溞進行24 和48h 的暴露實驗,從大型溞的固定率、復(fù)合體在大型溞腸道內(nèi)的累積情況以及抗氧化酶活性的角度,解析復(fù)合體對大型溞生理特性的影響,以期為評價環(huán)境中SPM-MC-LR 復(fù)合體的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

SPM 均取自于三峽庫區(qū)長江支流御臨河,其d50=6.79μm, d90=35.4μm.MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品和大型溞(Daphnia magna)購自中國科學(xué)院水生生物研究所,其中大型溞在恒溫光照培養(yǎng)箱中以溫度(20±1)℃、光暗時間比16:8 的實驗條件下進行培養(yǎng),并且每天用濃縮斜生柵藻(Scenedesmus obliquus,密度約為5×105cells/mL)進行飼喂.MC-LR 在滅菌水體中幾乎不存在降解,在自然水體中降解的半衰期為0.44～22d[16-18].整個實驗過程中使用的所有化學(xué)藥品均為分析純,所有使用的水均為超純水.

1.2 SPM 對MC-LR 的吸附

1.2.1 吸附動力學(xué) 稱取 0.04g SPM 于裝有100mL 1000μg/L MC-LR 溶液、添加有200mg/L 的NaN3(用于抑制微生物的生長)的遮光錐形瓶中,置于恒溫振蕩箱中(25℃,150r/min).分別在反應(yīng)0.5,1,2,4,12,24,36,48,60,72h 時間點取樣2mL 并過濾,采用高效液相色譜檢測MC-LR 的濃度變化,計算每個時間點的吸附量,擬合吸附動力學(xué)曲線,確定MC-LR在SPM 上的吸附平衡時間.

1.2.2 吸附等溫線 稱取0.008g SPM 于MC-LR濃度分別為0,200,400,600,800,1000,1200,1500,1800和2000μg/L 且添加有200mg/L 的NaN3的遮光錐形瓶中,置于恒溫振蕩箱中(25℃,150r/min)反應(yīng)36h.過濾后測定濾液MC-LR 濃度,計算每種MC-LR 濃度對應(yīng)的吸附量,擬合確定最佳吸附等溫模型.

1.2.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體的制備 泥沙濃度超過400mg/L 時會對藻類的生長產(chǎn)生抑制作用[19],本研究團隊的長期監(jiān)測數(shù)據(jù)表明三峽庫區(qū)支流-御臨河泥沙濃度在泄水期可達(dá)40～500mg/L.此外全球水體胞外MCs 平均濃度可達(dá)230.19μg/L[6].為了探究在環(huán)境濃度條件下SPM 吸附MC-LR后的復(fù)合體對水生態(tài)毒理模式生物大型溞的毒性作用,以初始濃度為160μg/L 的MC-LR 和400mg/L 的SPM 進行復(fù)合體的制備.根據(jù)SPM 吸附MC-LR 的吸附動力學(xué)過程,分別在第 0.5,2,6,12,24,48h 進行取樣,經(jīng)8000r/min 離心10min,取上清液過濾后測定MC-LR濃度,用于計算SPM 上所吸附的MC-LR 的量.將所得的復(fù)合體經(jīng)冷凍干燥后于干燥箱中保存,用于后續(xù)毒理實驗.

1.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體對大型溞的暴露實驗

將復(fù)合體制備的吸附動力學(xué)不同時間取樣得到的復(fù)合體,即分別對應(yīng)吸附初期(0.5h)、吸附中期(2h)、吸附后期(6h)以及吸附平衡(48h)4 個不同吸附階段的 SPM-MC-LR(31.51,52.52,73.52 和 94.53μg/g)添加至含有40mL 實驗液的100mL 燒杯中,其中SPM 濃度為400mg/L,同時設(shè)置不添加SPM 和MC-LR 的空白對照組以及只添加SPM(即MC-LR含量為0μg/g)的處理組,并準(zhǔn)確計數(shù)放入20 只7d 的大型溞,4 個燒杯為一組,便于實驗過程中大型溞存活率的計數(shù),每組實驗3 組平行.實驗前對大型溞進行6h 饑餓處理,實驗期間不喂食,其余實驗條件與飼養(yǎng)時一致.在實驗過程中,為了讓復(fù)合體始終保持懸浮狀態(tài),每隔5h 用玻璃棒輕輕攪動一次反應(yīng)液[20].

在實驗進行到24 和48h 時,利用光學(xué)顯微鏡和手動計數(shù)器對各處理組中的大型溞存活數(shù)量進行統(tǒng)計.輕輕搖動燒杯,若受試大型溞在15s 之內(nèi)不能游動,則認(rèn)定其為受抑制的個體.統(tǒng)計各個處理組的固定率,并計算相應(yīng)的EC50.在實驗初始以及實驗進行到第24,48h 時,從各個處理組中隨機選取3 只大型溞,用0.9%的生理鹽水洗去表面附著殘留的復(fù)合體,置于載玻片上于體視顯微鏡下觀察各處理組中大型溞攝食復(fù)合體情況.暴露實驗結(jié)束時,用浮游生物網(wǎng)收集大型溞,同時棄去死亡個體,用除氯自來水將大型溞沖洗1 次,接著用去離子水沖洗1 次,最后用0.9%的生理鹽水沖洗2 次,去除大型溞體表泥沙,并在濾紙上晾干,然后轉(zhuǎn)移到2mL 離心管中,于分析天平上稱重.經(jīng)液氮冷凍后將離心管中的大型溞全部轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中,并以1g: 9mL 的比例添加0.9%的生理鹽水,置于0℃冰-水混合水浴中充分研磨.勻漿結(jié)束后將勻漿液全部收集至離心管中,并在10000r/min、4℃下離心10min,收集上清液于-80℃冰箱保存直至分析[21].本實驗中酶活性測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒,按照說明操作測定各處理組中SOD、CAT、GST 活性和MDA以及組織中總蛋白質(zhì)含量,最后用總蛋白濃度進行歸一化處理.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進行處理,圖中數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”,采用IBM SPSS Statistics 26 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)來檢驗各組間的顯著性差異,當(dāng)P<0.05 時表明實驗樣本之間具有顯著性差異,并采用Origin 2023 學(xué)生版軟件對實驗數(shù)據(jù)進行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 SPM 對MC-LR 的吸附模型擬合

2.1.1 吸附動力學(xué) 如圖1(a)和表1 所示,在反應(yīng)初期的0～4h 內(nèi),SPM 上MC-LR 吸附量增加得較為迅速,隨后吸附量增加速率逐漸放緩,并在開始反應(yīng)后的第36h 達(dá)到吸附平衡.

表1 SPM 吸附MC-LR 動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 1 Parameters of kinetic adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

表2 SPM 吸附MC-LR 等溫吸附模型擬合參數(shù)Table 2 Parameters of isothermal adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

圖1 SPM 吸附MC-LR 的動力學(xué)模型擬合和等溫模型擬合Fig.1 Fitting of kinetic model and isothermal model for MC-LR adsorption by SPM

擬一級和擬二級動力學(xué)模型擬合的R2均大于0.95,說明這2 種模型都能很好地擬合該吸附動力學(xué)過程.SPM 吸附MC-LR 更符合擬二級動力學(xué)模型,即該吸附過程是多個吸附階段共同作用的結(jié)果[22],擬合的最大飽和吸附量為1583μg/g,也更接近實驗測定值.這表明MC-LR 主要是通過如絡(luò)合作用、氫鍵作用、共用電子對等化學(xué)作用力吸附在SPM 上[23].該結(jié)果與Maghsoudi 等[14]和Liu 等[24]進行的沉積物、泥沙吸附MCs 的吸附動力學(xué)過程擬合結(jié)果一致.

2.1.2 吸附等溫線 如圖 1(b)和表 2 所示,Langmuir、Freundlich、Temkin 這3 個模型擬合的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95,表明這3 種模型都能很好地擬合SPM 吸附MC-LR 的過程.Freundlich 模型擬合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)(R2)略大于其他2 種模型,這表明MC-LR 在SPM 上的吸附過程更符合Freundlich 模型,也就是說SPM 吸附MC-LR 是一種以化學(xué)吸附為主導(dǎo)的多分子層吸附過程,該研究結(jié)果與Mohamed 等[25]進行的沉積物吸附MCs 的實驗結(jié)果一致.且1/n 介于0～1 之間,表明MC-LR 在SPM 上的吸附較為容易進行.通過Langmuir 等溫吸附參數(shù)可知,該過程中SPM 對MC-LR 的最大吸附量可達(dá)1720μg/g.

2.2 大型溞固定率的響應(yīng)

毒理實驗中,固定率是最直觀地反映測定物濃度影響被試生物的指標(biāo).如圖2 所示,在暴露實驗期間,空白對照組中大型溞48h 固定率為4%,小于5%,表明利用本批次大型溞所進行的暴露實驗的實驗結(jié)果是合理的[26].同時,在SPM組中,經(jīng)過24h暴露后,大型溞的固定率為8.44%,略高于空白對照組,這表明SPM 可能對大型溞存在輕微毒性或者通過影響大型溞的活動使大型溞被固定.當(dāng)暴露實驗進行

暴露24h 時,MC-LR 劑量為31.51,52.52,73.52和94.53μg/g 的4 個處理組中大型溞的抑制率均存在顯著差異(P<0.05),且抑制率隨著復(fù)合體上MC-LR 含量的增加而增加;當(dāng)暴露實驗進行到第48h 時,MC-LR 劑量為31.51,52.52μg/g 的2 個處理組中大型溞固定率差異更加明顯,但MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個處理組中大型溞固定率差異不顯著(P>0.05),分別為84.44%和93.77%.在這2個MC-LR 劑量濃度下,幾乎所有大型溞的活動都受到了抑制,甚至已經(jīng)嚴(yán)重影響到大型溞的生理機能.此外,大型溞的24 和48h 的EC50分別為94.06 和44.37μg/g.

2.3 大型溞體內(nèi)SPM-MC-LR 復(fù)合體的生物累積

如圖3 所示,空白對照組中,實驗開始時經(jīng)過饑餓處理后的大型溞腸道內(nèi)僅有少量柵藻殘留,暴露實驗結(jié)束時,僅在腸道末端有少量未排出的殘留物.在MC-LR 劑量為0 和31.51μg/g 的2 個處理組中,經(jīng)過24 和48h 的暴露后,大型溞的腸道內(nèi)充滿了復(fù)合體顆粒物且分布較為均勻,這可能與大型溞的腸道蠕動有關(guān),在經(jīng)過48h 暴露實驗處理的大型溞的觸角上還附有少量復(fù)合體顆粒物.而在MC-LR 劑量為52.52,73.52,94.53μg/g 的3 個較高劑量處理組中,經(jīng)過24h 暴露實驗處理過后的大型溞腸道內(nèi)也均勻布滿復(fù)合體顆粒物,且其觸角上沒有出現(xiàn)明顯的復(fù)合體顆粒物附著;但在經(jīng)過48h 暴露實驗處理后,大型溞體表及觸角上顆粒附著物明顯增多,且在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個高劑量處理組中的大型溞腸道內(nèi)還出現(xiàn)了復(fù)合體顆粒物在前段腸阻塞現(xiàn)象,這可能是因為高濃度復(fù)合體顆粒物使大型溞生理活性受到抑制,大型溞腸道蠕動頻率降低,無法將復(fù)合體顆粒物排出體外.

圖3 初始,24 和48h 后不同處理組中SPM-MC-LR 復(fù)合體顆粒物在大型溞腸道累積情況Fig.3 Accumulation of complex particulate matter of SPMMC-LR in the intestines of Daphnia magna after 0, 24 and 48h exposure in different treatment groups

2.4 大型溞體內(nèi)酶活性的響應(yīng)

當(dāng)大型溞暴露在不同劑量的復(fù)合體顆粒物當(dāng)中時,可能會破壞大型溞體內(nèi)的生物氧化劑與抗氧化劑比例的平衡,導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高,從而對細(xì)胞造成損傷[27].丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,是評價自由基引起嚴(yán)重氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷的指標(biāo).由于氧化應(yīng)激是對應(yīng)激因素的第一反應(yīng),細(xì)胞最初啟動抗氧化防御和解毒過程.超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)在抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程中起著至關(guān)重要的作用,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)主要參與細(xì)胞解毒過程.

MDA 是生物體發(fā)生脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物,通過測定生物體內(nèi)MDA 的含量,可反映出生物體脂質(zhì)氧化的程度,從而間接反映生物體內(nèi)細(xì)胞損傷的程度[28].由圖4(a)可知,與對照組相比,在經(jīng)過24h 暴露處理后,MC-LR 劑量為0μg/g 處理組中MDA 含量稍高于空白對照組,且存在顯著差異(P<0.05);但在經(jīng)過48h暴露處理后,0μg/g處理組中MDA含量明顯低于對照組,說明大型溞吞食SPM 顆粒能夠稍微減緩由于饑餓而產(chǎn)生的氧化損傷.同時,在經(jīng)過48h 暴露處理后,5 個處理組中的MDA 含量呈正向劑量依賴,且各處理組中MDA 含量存在顯著差異(P<0.05).

CAT 的主要功能是將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2以減少其對機體的傷害;一般情況下,發(fā)生氧化應(yīng)激時,生物體內(nèi)的SOD 和CAT 的變化趨勢同步[29].如圖4(c)所示,在經(jīng)過24 和48h 暴露處理后,各個處理組中CAT 活性變化趨勢與SOD 完全一致,且酶活性變化均與復(fù)合體顆粒物上MC-LR 的劑量呈正相關(guān),這表明生物體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時,可通過SOD 和CAT 的共同作用來減少機體內(nèi)活性氧自由基對于機體的氧化損傷程度.在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 這2 個高劑量處理組中,經(jīng)過48h 暴露處理后的SOD 和CAT 活性相較于24h 時均有降低(SOD 和CAT 分別降低了17.66%、20.96%和5.84%、15.45%),這可能是大型溞體內(nèi)的活性氧自由基過高,造成部分細(xì)胞直接失活,從而導(dǎo)致大型溞抵抗氧化應(yīng)激的能力減弱.Cui等[30]將大型溞急性暴露于農(nóng)藥氟苯二胺中,也觀察到類似的抗氧化酶活性變化.

GST 是一種多功能酶,其主要作用是代謝脂質(zhì)過氧化物以及參與催化谷胱甘肽(GSH)與異種生物和細(xì)胞毒醛的結(jié)合,能夠?qū)C-LR 轉(zhuǎn)化為具有更強水溶性以及更好排泄的谷胱甘肽絡(luò)合物(GSH).有研究證實GST 活性隨暴露污染物濃度的增加而升高[11,31-32].如圖4(d)所示,在經(jīng)過24h 暴露處理后,各處理組中的GST 活性相較于對照組均有不同程度的升高(分別增加了0.8029 倍、1.634 倍、3.251 倍、5.432 倍和5.887 倍)并存在顯著差異(P<0.05),且GST 活性隨著復(fù)合體顆粒物上MC-LR 劑量的增加而升高.經(jīng)過48h 暴露處理后,各處理組中的GST 活性較對照組仍有不同程度的增加,并且依舊呈現(xiàn)出正向劑量依賴性,但在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個處理組中GST 活性不存在顯著差異(P>0.05).綜合來看,GST 活性呈劑量和時間依賴性增加.

3 討論

3.1 SPM-MC-LR 復(fù)合體對大型溞的固定率呈正向劑量和時間依賴性

比較各處理組中24h 和48h 大型溞的固定率可以發(fā)現(xiàn),在MC-LR 劑量為52.52,73.52,94.53μg/g 這3個處理組中,相較于24h大型溞的固定率,48h時大型溞的固定率增加幅度較大,分別增加了1.56 倍、1.09倍和0.79 倍,且24h 的EC50相比于48h 增加了1.12倍,這表明高濃度復(fù)合體顆粒物對大型溞的毒性作用不僅表現(xiàn)出正向劑量依賴性,同時還表現(xiàn)出正向時間依賴性(圖5 路徑④).

大型溞作為一種非選擇性濾食性浮游動物,可以無選擇性地攝取小于70μm的小顆粒物質(zhì)[33],本研究所用SPM 幾乎都能通過大型溞攝食行為進入到腸道內(nèi).SPM 所具有的小粒徑、高比表面積等特性為MC-LR 的吸附提供了充足的吸附位點,MC-LR以吸附在SPM 上的方式進入大型溞的腸道內(nèi),并能在大型溞體內(nèi)消化液的作用下被解吸出來,相較于MC-LR 溶液,經(jīng)顆粒物負(fù)載后MC-LR 在大型溞體內(nèi)的生物累積明顯增加[34-35];其他研究也表明,當(dāng)納米二氧化鈦顆粒存在時,鎘等重金屬在金魚和大型溞體內(nèi)的生物累積量明顯增加[36-37].高劑量復(fù)合體顆粒物上所吸附的MC-LR 量更大,解吸出來的MC-LR 對大型溞產(chǎn)生的生物毒性也更強.因此,在梯度劑量復(fù)合體顆粒物暴露實驗結(jié)束時,其對大型溞的固定率呈現(xiàn)正向的劑量、時間依賴性.值得注意的是,MC-LR 劑量為94.53μg/g 處理組(若MC-LR全部解吸,體系中MC-LR 的濃度可達(dá)37.81μg/L)中,大型溞48h 固定率高達(dá)93.77%,與Wan 等[10]的研究中25mg/L MC-LR 單獨暴露對應(yīng)的固定率相近,而且該研究中48h的EC50(13.46mg/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究(若全部解吸,體系中MC-LR 濃度為17.75μg/L),表明SPM 可以大幅度增強MC-LR 對大型溞的毒性.類似的研究指出懸浮顆粒物存在時,同一濃度下菲對大型溞的固定率可以提高1.6～2.7 倍[35].

3.2 SPM-MC-LR 復(fù)合體影響大型溞的游泳行為和腸道蠕動功能

微納米塑料可通過靜電相互作用等粘附于大型溞體表和觸角上,從而導(dǎo)致大型溞被固定下來甚至造成物理損傷[38-39].本研究中也發(fā)現(xiàn),復(fù)合體顆粒物會在大型溞的體表和第二觸角上粘附(圖3),第二觸角是大型溞運動的重要器官,運動受阻也可能是大型溞被固定的原因之一.從復(fù)合體顆粒物中解吸出來的MC-LR 對大型溞所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性也會使得其游動速度大大降低,從而更有利于顆粒物在觸角上的附著,進而對大型溞的游泳行為產(chǎn)生負(fù)面影響,最終對其生存造成威脅[40-41].

研究表明,微納米顆粒容易在大型溞的胸足部和消化道內(nèi)累積[38,42],嚴(yán)重時還可能出現(xiàn)腸道阻塞現(xiàn)象[43].本實驗中MC-LR 劑量為52.52,73.52 和94.53 μg/g 的3 個高劑量處理組中,暴露實驗結(jié)束時,出現(xiàn)了復(fù)合體顆粒物在大型溞腸道前端堆積的現(xiàn)象,這可能是因為復(fù)合體顆粒物上解吸出來的MC-LR 所產(chǎn)生的毒性作用使得大型溞腸道蠕動功能減弱甚至喪失,大型溞不能通過腸道蠕動將復(fù)合體排出體外,反向增加了復(fù)合體顆粒物在腸道內(nèi)的解吸時間,從而加重了復(fù)合體顆粒物對大型溞的毒性作用(圖3).當(dāng)大型溞攝食微塑料后,規(guī)則的微塑料比不規(guī)則的微塑料更容易排出體外,對大型溞的毒性作用也更弱[44].SPM 不規(guī)則的形狀也增加了復(fù)合體顆粒物在腸道內(nèi)的接觸時間.但在微納米塑料對大型溞的暴露實驗中,大型溞所表現(xiàn)的一切現(xiàn)象均是因微納米塑料對大型溞產(chǎn)生了毒性作用.在本研究當(dāng)中,SPM 對大型溞幾乎沒有毒性作用,僅作為一種污染物載體;但吸附在SPM 上的MC-LR 通過大型溞攝食SPM 而進入其腸道內(nèi),在消化液的作用下解吸出來,從而對大型溞產(chǎn)生毒性作用.

3.3 大型溞在SPM-MC-LR 復(fù)合體作用下產(chǎn)生氧化應(yīng)激

當(dāng)大型溞體內(nèi)出現(xiàn)脅迫引起氧化應(yīng)激時,體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來維持機體的正常運轉(zhuǎn).MDA 含量的上升表明大型溞體內(nèi)出現(xiàn)的氧化應(yīng)激程度已經(jīng)超出了抗氧化酶調(diào)節(jié)的閾值,從而導(dǎo)致大型溞體內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化(圖5路徑①)[45],這可能會導(dǎo)致大型溞的死亡(圖4(a)).

SOD-CAT 系統(tǒng)是機體發(fā)生氧化應(yīng)激時抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,SOD-CAT 這2 種酶活性增加能夠有效清除氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的和H2O2等活性氧自由基,從而減輕其對機體的氧化損傷[34].因此,在經(jīng)過24 和48h 的梯度劑量復(fù)合體顆粒物暴露處理后,各處理組中的SOD 和CAT 酶活性均有不同程度的升高(圖4(b)和(c)),表明大型溞攝食復(fù)合體顆粒物后,導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激.但在MC-LR 劑量為73.52 和94.53 μg/g 的2 個處理組中,48h 暴露結(jié)束后,大型溞體內(nèi)的SOD 和CAT 酶活性較24h 分別降低了21.44%、26.51%和6.2%、18.27%,結(jié)合圖2各組中固定率的變化情況來看,這2 個處理組中的大型溞可能出現(xiàn)了氧化應(yīng)激的程度過高的現(xiàn)象,導(dǎo)致SOD 和CAT 抗氧化酶的活性被抑制(圖5 路徑②)[46].對照組中SOD 和CAT 活性升高可能是由饑餓引起的ROS 活性上升,Bu 等[47]已經(jīng)證實了短期禁食會使得魚體內(nèi)的ROS 和MDA 含量明顯增加.暴露結(jié)束時,0 μg/g 處理組中SOD 和CAT 酶活性稍有降低,表明吞食SPM 顆粒能夠為大型溞的生存提供一定的營養(yǎng)物質(zhì),這在一定程度上減輕饑餓帶來的氧化損傷(圖4(b)和(c)).Zhang 等[48]的研究證實了這一點,該研究將大型溞暴露在含400mg/L 的天然懸浮顆粒物(d50=38.42 μm)溶液中,即使7d 不喂食,大型溞仍舊十分活躍,即懸浮顆粒物可能能為大型溞的生存提供必要的營養(yǎng)物質(zhì).

GST 是抗氧化系統(tǒng)的第二道防線,主要負(fù)責(zé)MC-LR 的生物轉(zhuǎn)化以及脂質(zhì)過氧化物的代謝[11,49],GST 活性的升高則表明機體內(nèi)發(fā)生的氧化應(yīng)激靠第一道防線已經(jīng)不能調(diào)節(jié)[34].在經(jīng)過24 和48h 暴露處理后,5 個梯度劑量復(fù)合體顆粒物處理組中,GST活性變化呈正向劑量和時間依賴(圖4(d)).Ortiz 等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MC-LR 濃度(>50μg/L)過高時,大型溞體內(nèi)的GST 活性會降低,即大型溞對MC-LR 的解毒功能會受到抑制.本研究中GST 活性并沒有下降,表明從復(fù)合體顆粒物中解吸出來的MC-LR 還沒有達(dá)到抑制大型溞生物解毒能力的濃度(圖5 路徑③).同時,GST 活性呈現(xiàn)出的正向劑量、時間依賴性也表明在暴露實驗的整個過程中,所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)都必須靠兩道防線的共同作用.此外,研究表明7d 齡大型溞經(jīng)過10μg/L MC-LR 的48h 暴露后,GST活性相較于對照組增加不到1 倍[11],低于本研究中MC-LR 劑量為31.51μg/g 處理組(若MC-LR 全部解吸,體系中MC-LR 的濃度可達(dá)12.60μg/L)的GST 活性增量(1.5 倍),表明SPM-MC-LR 復(fù)合體的毒性強于游離的MC-LR.

本研究中,由MC-LR 在大型溞體內(nèi)所引起的氧化應(yīng)激、毒性作用和顆粒物附著在體表及觸角上對于大型溞行動限制的共同作用使得大型溞被固定下來(圖5 路徑⑤).但在SPM 濃度一致的條件下,綜合5 個梯度劑量復(fù)合體顆粒物處理中大型溞的固定率來看,從復(fù)合體顆粒物中解吸出來的MC-LR 誘導(dǎo)發(fā)生的氧化應(yīng)激和產(chǎn)生的毒性作用才是導(dǎo)致高固定率出現(xiàn)的主因(圖5).

4 結(jié)論

4.1 SPM吸附MC-LR的平衡時間為36h,擬合最大吸附量為1720μg/g.該吸附過程更符合擬二級動力學(xué)模型和Freundlich 等溫吸附模型,是一種較為容易發(fā)生的以化學(xué)吸附為主導(dǎo)的多分子層吸附.

4.2 MDA 含量、SOD 和CAT 活性以及GST 活性均呈正向劑量和時間依賴,但當(dāng)復(fù)合體濃度較高時(MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g),大型溞組織內(nèi)氧化應(yīng)激程度過高會抑制SOD 和CAT 活性.

4.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體能夠在大型溞體內(nèi)引起氧化應(yīng)激、產(chǎn)生毒性以及在大型溞體表和觸角上黏附.在上述過程作用下大型溞被固定下來,且固定率呈正向劑量和時間依賴.

4.4 SPM 幾乎不會對大型溞產(chǎn)生毒性作用,但是其作為污染物載體,吸附MC-LR 后可能產(chǎn)生相比于游離MC-LR 更為明顯的毒性.